楊小斌，曾榮華，鄧穎詩，魏星，許文東，袁誠，關(guān)偉鍵，王浩

（1.中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心 廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司，廣東廣州 510240；2.西藏林芝廣藥發(fā)展有限公司 中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心藏藥分中心，西藏波密 850300）

羊肚菌（Morchella esculenta）在我國主產(chǎn)于西藏、甘肅、湖南、青海、云南、新疆、四川、山西等地[1]。近幾年，有關(guān)羊肚菌的研究內(nèi)容主要涉及地理環(huán)境、資源分布、生長周期、人工栽培、功能、藥理作用以及產(chǎn)品開發(fā)等方面[2]。

羊肚菌含粗蛋白20%、粗脂肪26%、碳水化合物38.1%，還含有多種氨基酸、黃酮、色素、多糖、皂甙類等成分[3-4]，是一種珍稀的食藥兩用真菌，屬高級(jí)營養(yǎng)滋補(bǔ)品。羅霞等[5]研究指出，尖頂羊肚菌菌絲體水提液能增加胃黏液分泌，并且提高機(jī)體的抗氧化能力，對(duì)酒精引起的大鼠急性胃黏膜損傷有保護(hù)作用。吳映明等[6]發(fā)現(xiàn)羊肚菌提取液可明顯加強(qiáng)正常小鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)，新斯的明負(fù)荷小鼠食用羊肚菌提取液，對(duì)其胃腸推進(jìn)亢進(jìn)也有明顯的拮抗作用。殷偉偉等[7]對(duì)尖頂羊肚菌活性提取物的降血脂作用的研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期后，發(fā)現(xiàn)尖頂羊肚菌活性提取物能顯著地降低高脂模型小鼠血清TC、TG、LDL-C、脾指數(shù)和腎指數(shù)，具有良好的降血脂效果。Kalyoncu等[8]研究了不同真菌菌絲體的抗氧化效果，發(fā)現(xiàn)高羊肚菌乙醇提取物清除羥基自由基的能力最強(qiáng)，抗氧化活性最好。Kim等[9]研究表明羊肚菌提取物能有效清除結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29羥基自由基，抗氧化效果顯著。趙英等[10]從DPPH自由基清除能力、還原能力和羥基自由基清除能力3個(gè)方面評(píng)估了羊肚菌甲醇提取物的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)羊肚菌在不同抗氧化途徑中均具有良好的抗氧化活性，說明羊肚菌中含有某些具有抗氧化能力的化合物。

目前，對(duì)羊肚菌營養(yǎng)素和功能成分的研究趨向于蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)，對(duì)氨基酸、微量元素的研究僅限于生物學(xué)水平，沒有對(duì)其進(jìn)行深入的研究[11]。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）作為一種簡單的模式生物，具有生長周期短、遺傳背景清晰、表型容易觀察等優(yōu)點(diǎn)[12]，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中發(fā)揮了重要作用，并在用于植物提取物的抗氧化損傷方面的研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[13]。本研究以秀麗隱桿線蟲為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ缴?，?duì)羊肚菌水提取物的體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行研究，觀察其正常壽命、產(chǎn)卵量、運(yùn)動(dòng)行為、體內(nèi)脂褐素含量（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力的影響，旨在為相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

1.1.1 主要試劑

羊肚菌水提物，實(shí)驗(yàn)室提??；秀麗隱桿線蟲（C.elegans）:N2野生型秀麗隱桿線蟲及大腸桿菌OP50由遺傳學(xué)中心所提供。LB肉湯:廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨:廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司；H2DCF-DA（2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯）:Sigma公司；SOD試劑盒、CAT試劑盒:南京建成生物工程研究所；其余均為分析純。

1.1.2 主要設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)（上海博恒實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠）、萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、UV-3010紫外分光光度計(jì)（日本日立高科技公司）、Enspire2003多功能酶標(biāo)儀（美國pE公司）、FD-4型冷凍干燥機(jī)（labCAN）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊肚菌水提物制備

準(zhǔn)確稱取50 g羊肚菌粉末（購于西藏林芝縣）于1 000 mL 圓度燒瓶中，加水 500 mL，100 ℃回流提取90 min，過濾，濾渣回流提取 60 min，抽濾合并提取物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、濃縮、真空冷凍干燥，配制成濃度為0、25、100、200 mg/mL的羊肚菌水提物溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)

線蟲生長培養(yǎng)基（Nematode Growth Medium，NGM）參考文獻(xiàn)[14]。配制不同濃度（0、25、100、200 mg/mL）的羊肚菌水提物溶液，過濾除菌后，與大腸桿菌OP50菌液以5∶95的比例混合均勻。吸取100 μL樣品于NGM平板上，喂養(yǎng)線蟲。生長到L4期的線蟲即可進(jìn)行同期化。約48 h后線蟲受精卵基本發(fā)育成L4期幼蟲，完成同期化，可用于各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3 對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響測(cè)定

挑取同期化后的L4期線蟲到各組培養(yǎng)基當(dāng)中，每個(gè)板中約有30條，每組設(shè)3個(gè)平行。從轉(zhuǎn)移時(shí)刻起開始計(jì)算線蟲的存活天數(shù)，轉(zhuǎn)移當(dāng)天記為實(shí)驗(yàn)的第0天，每天將它們轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿當(dāng)中，到第4天后隔天將線蟲轉(zhuǎn)移到新的平板中以保證食物的充足。隔天探視線蟲，并記錄線蟲死亡數(shù)。對(duì)線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為無移動(dòng)及吞咽等動(dòng)作，輕觸后仍然無任何反應(yīng)[15]。

1.2.4 對(duì)秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵量的測(cè)定

每組挑取10條處于L4時(shí)期的線蟲到各組培養(yǎng)基中，每個(gè)平板中放置2條線蟲。每隔24 h后將線蟲轉(zhuǎn)移至新的平板中，轉(zhuǎn)移4～5次后，線蟲基本上已經(jīng)不再產(chǎn)卵。將所有平板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中20 ℃孵育24 h后，待子代線蟲孵化長大后，在其進(jìn)入產(chǎn)卵期之前，對(duì)線蟲的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每條母線蟲在6～7個(gè)平板中產(chǎn)卵數(shù)的總和就是該線蟲的產(chǎn)卵數(shù)量。

1.2.5 對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平的影響

ROS水平測(cè)定:經(jīng)羊肚菌水提物處理96 h以后，將不同濃度組線蟲轉(zhuǎn)移到NGM板上以去除大腸桿菌。轉(zhuǎn)移3次后，把線蟲轉(zhuǎn)移到含有50 μL的M9緩沖液的96孔熒光板上，每孔轉(zhuǎn)移80條，每組設(shè)三個(gè)平行。與此同時(shí)將50 μL用M9緩沖液配制的100 μM的H2DCF-DA溶液加入到96孔板當(dāng)中，用不含線蟲的 H2DCF-DA 溶液50 μL 加 50 μL M9緩沖液做空白對(duì)照。立即將96孔板放入酶標(biāo)儀當(dāng)中測(cè)定熒光強(qiáng)度，反應(yīng)溫度25 ℃，發(fā)射波長528 nm，激發(fā)波長485 nm。每次讀數(shù)前振蕩，每隔20 min測(cè)定一次，共反應(yīng) 6 h。

1.2.6 羊肚菌水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD和CAT酶活力的影響

前期培養(yǎng)方法與壽命實(shí)驗(yàn)一樣，經(jīng)藥物處理96 h以后，分別從空白組、樣品組和陽性對(duì)照組挑200條線蟲放入無菌水中沖洗，低速離心后去掉上清液，反復(fù)三次后定容至0.5 mL，低溫勻漿（重復(fù)勻漿2次，1 s勻漿、1 s間隙，每次2 min）。勻漿后加入1%chap溶液定容至 1 mL，低溫離心（4 ℃，12 000 r/min，15 min），收集上清液放置到4 ℃中待測(cè)。酶活力的測(cè)定，嚴(yán)格按照南京建成生物工程所SOD和CAT測(cè)試盒說明書要求的操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

將不同濃度條件下得到的各組數(shù)據(jù)即線蟲壽命、體長、線蟲一分鐘活動(dòng)次數(shù)和線蟲體內(nèi)熒光密度等數(shù)據(jù)使用Origin軟件進(jìn)行繪圖，SPSS17.0 軟件數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

本實(shí)驗(yàn)通過比較3個(gè)不同濃度的羊肚菌水提物樣品對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響，對(duì)線蟲整個(gè)壽命周期的存活率做出壽命生存曲線圖，如圖1所示。羊肚菌水提物處理組秀麗隱桿線蟲的平均壽命、最長壽命均高于對(duì)照組，且與羊肚菌水提物濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。100 mg/L與200 mg/mL組秀麗隱桿線蟲的平均壽命顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明羊肚菌水提取物可以顯著延長秀麗隱桿線蟲壽命。但是，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 mg/mL時(shí)，秀麗隱桿線蟲壽命提升率無顯著差異（P＞0.05），結(jié)果如表1所示。

圖1 羊肚菌水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

表1 對(duì)線蟲壽命的影響

2.2 羊肚菌水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵量的影響

由不同濃度（0、25、100、200 mg/mL）的羊肚菌水提物溶液喂養(yǎng)線蟲的總產(chǎn)卵量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。25 mg/mL羊肚菌水提物組秀麗隱桿線蟲子代數(shù)量達(dá)到248個(gè)，顯著高于對(duì)照組（p＜0.05）。而且線蟲產(chǎn)卵量隨著羊肚菌水提物濃度的增加而增加，25 mg/mL、100 mg/L、200 mg/L組間線蟲產(chǎn)卵量均無顯著性差異（p＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本研究所得羊肚菌水提物能提高線蟲產(chǎn)卵量，但濃度的增加不會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲生殖能力造成顯著影響（p＜0.05）。

表2 羊肚菌水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵量的影響

2.3 羊肚菌水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，羊肚菌水提物能夠顯著降低線蟲體內(nèi)ROS積累量（p＜0.05），而且隨著濃度的增大，ROS越小，100 mg/L與200 mg/L羊肚菌水提物組ROS水平分別下降了37.44%和23.50%，組間無顯著差異。

表3 羊肚菌水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS的影響

2.4 羊肚菌水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD和CAT酶活的影響

如圖2所示，在考察質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，羊肚菌水提物均可以顯著提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD、CAT活力（P＜0.05）。對(duì)照組0 mg/mL的羊肚菌水提物組的 CAT 活力為（150.05±1.00）U/mg prot，與對(duì)照組相比，25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL 羊肚菌水提物組使CAT活力分別提高了26.11%、31.52%和37.41%。

如圖3所示，不同濃度羊肚菌水提物組的SOD活力均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL 羊肚菌水提物組使SOD活力分別提高了55.46%、66.40%和75%。25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL 羊肚菌水提物組間對(duì)SOD活力的影響無顯著差異。

圖2 羊肚菌水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)CAT的影響

圖3 羊肚菌水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD的影響

3 結(jié)論

秀麗隱桿線蟲作為一個(gè)完整且簡單的生命體，以其低成本、高效率的特點(diǎn)在活性成分評(píng)價(jià)方面優(yōu)于小鼠等其他模式生物[16]，在植物提取物的體外和體內(nèi)抗氧化活性之間架起了一座橋梁[17]，是研究植物提取物的抗氧化作用不可或缺的工具[18-19]。本研究以秀麗隱桿線蟲為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ缴?，?duì)羊肚菌水提取物的體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行研究，觀察其正常壽命、產(chǎn)卵量、體內(nèi)脂褐素含量（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力的影響，發(fā)現(xiàn)羊肚菌水提物處理組秀麗隱桿線蟲的平均壽命、最長壽命均高于對(duì)照組，且與羊肚菌水提物濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。線蟲產(chǎn)卵量隨著羊肚菌水提物濃度的增加而增加，但濃度的增加不會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲生殖能力造成顯著影響（p＜0.05）。與對(duì)照組0 mg/mL相比，羊肚菌水提物能夠顯著降低線蟲體內(nèi)ROS積累量（p＜0.05），而且隨著濃度的增大，ROS越小，100 mg/L下降了37.44%和200 mg/L 23.50%。羊肚菌水提物均可以顯著提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD、CAT活力p＜0.05）。與對(duì)照組相比，25 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL羊肚菌水提物組使SOD酶活力分別提高了55.46%、66.40%和75%；使CAT活力分別提高了26.11%、31.52%和37.41%。

綜上所述，羊肚菌水提物可以提高相關(guān)抗氧化酶活力、有效減少線蟲體內(nèi)脂褐素積累、使得線蟲壽命得到有效延長，改善機(jī)體的抗氧化能力。