方翟 ，馬小龍 ，高慶華 ＊

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

綿羊主要組織相容性復(fù)合體，又稱為綿羊淋巴細(xì)胞表面抗原，存在于20號染色體上，是由Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類區(qū)域組合而成，多態(tài)性較高。前人研究結(jié)果表明，在Ⅱ類區(qū)域的DQ和DR亞區(qū)多態(tài)性集中[1]。其第2外顯子為功能區(qū)，因此MHC的研究集中在DRB3基因第2外顯子上[2]。

MHC分子可作為動(dòng)物抗病力的遺傳標(biāo)記，主要原因在于眾多研究表明其多態(tài)性與家畜的抗病、易感性高度相關(guān)性[3]。MHC分子可以用來作為一個(gè)候選標(biāo)記基因的抗病性，是由于它的抗原呈遞和對動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)作用，它是動(dòng)物抗病育種和免疫遺傳學(xué)中的活躍部分[4-5]。MHC基因的高度多態(tài)性在疾病抗性及生殖調(diào)控中發(fā)揮著十分重要的作用，因此MHC基因已成為全球免疫學(xué)家的廣泛研究對象。1998年Hedrick首次利用MHC基因用檢測了瀕危物種的自然種群的遺傳變異。其后該基因被廣泛用于種群進(jìn)化、自然選擇、近交衰退、生存及繁殖的適應(yīng)性等研究[6]。另外，MHC的多態(tài)性是一種遺傳性狀，家畜任一經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳都受其控制，控制MHC遺傳性狀的基因可能會有某種直接或間接的聯(lián)系，如能發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)系，就可能應(yīng)用MHC的多態(tài)性來進(jìn)行優(yōu)良個(gè)體的選育或品種的改良。對動(dòng)物MHC遺傳多樣性的研究，可以為畜禽遺傳資源的保護(hù)和利用提供依據(jù)。

MHC基因在機(jī)體免疫系統(tǒng)上的重要作用，讓它成為家畜抗遺傳育種的研究熱點(diǎn)。脊椎動(dòng)物中MHC基因的突出特點(diǎn)是多態(tài)程度高而且多堿基突變。近幾年來，國內(nèi)與綿羊MHC-DRB3基因相關(guān)的研究陸續(xù)出現(xiàn)，2002年劉云芳應(yīng)用PCR -RFLP方法對新疆部分綿羊品種MHC-DRB3基因的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究[7]；尚友國（2005）分析了山東四個(gè)地方綿羊品種DRB3基因的多態(tài)性[8]；楊易等人（2006）對四川四個(gè)地方綿羊群體MHC-DRB3外顯子2的多態(tài)性也進(jìn)行了研究[9]；另外，吐爾孫江·努爾麥麥提對新疆部分綿羊品種MHC-DRB3基因遺傳多態(tài)性研究中在和田羊的41個(gè)序列中共發(fā)現(xiàn)290個(gè)突變位點(diǎn)、在塔什庫爾干羊的32個(gè)序列中共發(fā)現(xiàn)203個(gè)突變位點(diǎn)[10]，他們的結(jié)果都表明綿羊MHC-DRB3基因的多態(tài)性非常豐富。

本研究通過直接測序的方法對多浪羊的MHCDRB3基因第2外顯子進(jìn)行序列檢測和分析，了解多浪羊DRB3基因的多態(tài)性分布情況，并期望能篩選出幾個(gè)能夠作為遺傳標(biāo)記的多態(tài)位點(diǎn)。為今后多浪羊MHC-DRB3基因多態(tài)性的進(jìn)一步研究和多浪羊的育種提供理論以及技術(shù)上的參考加快多浪羊遺傳育種的進(jìn)展。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

在塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站選取23只多浪羊。多浪羊頸靜脈無菌采血10mL/只，肝素鈉抗凝，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 PCR引物設(shè)計(jì)

參考劉云芳等[7]的文獻(xiàn)以及GenBank數(shù)據(jù)庫綿羊MHC-DRB基因Z11520序列，利用PrimerPremier5.0和OLIGO6.0軟件進(jìn)行DRB3基因第二外顯子的引物設(shè)計(jì)，目的片段309bp；引物是由上海生工生物技術(shù)公司合成。

PrimerDRB3-F:5′-TCCTCATTAGCCTCTCCCCA-3′

PrimerDRB3-R:5′-TGGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3′

1.1.3 主要試劑

引物、2×PCRMix、血液基因組DNA提取試劑盒，均購自天根生化科技北京有限公司；瓊脂糖、2000DNAMarker、DNALoadingBuffer等。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增體系

PCR反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.2.2 PCR擴(kuò)增條件

94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 30s、60℃復(fù)性30s、72 ℃延伸 1 min，72℃延伸 10 min，35 個(gè)循環(huán)。

將檢驗(yàn)合格的PCR產(chǎn)物編號，放置于有冰袋的泡沫箱子中，密封，寄送到上海生工生物工程有限公司上海測序部，雙通測序。

2 結(jié)果及分析

2.1 DNA提取結(jié)果

按照血液基因組DNA提取試劑盒的提取要求將采集到的多浪羊血樣進(jìn)行DNA提取，將提取物在EB中染色后在凝膠成像檢測儀內(nèi)檢測，得到一條DNA條帶，見圖1。

圖1 多浪羊DNA提取結(jié)果

（1-10為血液DNA提取物）

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對23個(gè)多浪羊DNA樣液中的MHC-DRB3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EB染色后在凝膠成像檢測儀內(nèi)檢測，結(jié)果得到了一條約309bp的特異性條帶，見圖2。

圖2 多浪羊MHC-DRB3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 測序結(jié)果

2.3.1 DRB3基因序列比對結(jié)果

用DNAMAN6.0軟件對23只多浪羊的同源性比較結(jié)果表明，23個(gè)序列之間的同源性在90%以上，見圖3。

圖3 DRB3基因序列檢測

多浪羊DRB3基因第2外顯子序列中，A、T、C、G 4種堿基的比例分別為22.5%、19%、24.1%和34.4%，GC的含量明顯高于AT。包括46個(gè)突變位點(diǎn)，其中堿基置換22個(gè)。

4 分析與討論

本試驗(yàn)利用直接測序DR技術(shù)測定23只多浪羊的DNA序列，發(fā)現(xiàn)46個(gè)突變位點(diǎn)，說明MHC-DRB3基因在多浪羊中的多態(tài)性極為豐富。這個(gè)結(jié)果可能與所檢測的多浪羊的來源有關(guān)，各多浪羊來源于南將各個(gè)區(qū)域，存在地域差異。但本試驗(yàn)用直接測序法得到的試驗(yàn)結(jié)果表明，多浪羊MHC-DRB3基因的多態(tài)性極為豐富，它能夠在品種水平上反映多浪羊種內(nèi)的遺傳差異。

5 結(jié)論

本研究對23只多浪羊的MHC-DRB3第2外顯子基因測序分析結(jié)果表明，多浪羊的MHC-DRB3基因第2外顯子在種內(nèi)具有較高的多態(tài)性。