周 劍，李 強，柯紅雨，劉 超，蘇旭濤，肖 宇，孫甲華，王新宇，張 露

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，四川 成都 611731)

【研究意義】中華沙鰍(Sinibotiasuperciliaris)主要分布于長江中上游水系，肉質(zhì)細嫩、味道鮮美，營養(yǎng)價值和藥用價值兼?zhèn)洌黄潴w態(tài)纖細，色彩艷麗，在觀賞魚市場也有良好的前景[1]。近年來，中華沙鰍由于過度捕撈，加之修建水利工程等對其自然繁殖環(huán)境的破壞，使其野生資源逐步減少，單價逐年上漲?！厩叭搜芯窟M展】目前，對中華沙鰍的研究主要集中在中華沙鰍的資源現(xiàn)狀[2]、人工馴養(yǎng)和繁殖技術(shù)[3]、繁殖生物學(xué)[4-5]、消化系統(tǒng)結(jié)和功能[6]、胚胎發(fā)育[7]、年齡與生長[8]、食性[9]、營養(yǎng)成分[10]、疾病防治[11]、微衛(wèi)星[12-13]、線粒體[14]以及遺傳多樣性[15]等多個方面。動物繁殖性能相關(guān)的研究一直備受關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)動物的繁殖性能與血液生化指標(biāo)存在較強的相關(guān)性，總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、總膽固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)等指標(biāo)與鴨的繁殖性能均存在一定相關(guān)性[16-17]，而CHOL、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)等指標(biāo)在鶴不同繁殖期也存在較大差異[18]。繁殖過程中魚類會通過血液生理生化指標(biāo)的改變來適應(yīng)生理需要，已有的研究表明TP、ALB、GLO和血糖(GLU)等指標(biāo)與性腺發(fā)育存在密切關(guān)系，血液生化指標(biāo)的測定對于魚類性腺發(fā)育時期的判定和提高人工繁殖技術(shù)都具有重要意義[19-20]。關(guān)于魚類性腺發(fā)育的研究歷來受到重視，了解魚類性腺發(fā)育規(guī)律及其特點是魚類繁殖生理學(xué)中最為基礎(chǔ)的工作內(nèi)容。中華沙鰍繁殖過程中卵巢組織學(xué)變化特征和血液生化指標(biāo)變化規(guī)律的研究尚未見詳細報道?！颈狙芯壳腥朦c】本文通過對中華沙鰍繁殖過程中卵巢組織學(xué)特征和血液生化指標(biāo)變化規(guī)律進行探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】旨在為中華沙鰍繁殖過程中卵母細胞變化規(guī)律、不同時期的卵徑和血液生化指標(biāo)提供參考數(shù)據(jù)，為進一步探究中華沙鰍繁殖過程中的卵巢發(fā)育特點、提高中華沙鰍繁殖力和了解其繁殖期健康狀況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

按照中華沙鰍的產(chǎn)卵特點將其整個繁殖過程分為繁殖前期(3-4月)、繁殖期(5-7月)、繁殖后期(8-9月)3個時期，分別于3、6、8月中旬采集不同時期雌性中華沙鰍血液樣本和不同時期完整卵巢組織各5例，組織樣本用4 %多聚甲醛固定備用，采用斷尾采血法收集血液樣本，置于1.5 mL離心管中，經(jīng)靜置后采用3000 r/min離心15 min，分離血清后，-80 ℃保存待測。試驗所用中華沙鰍個體均為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所人工培育達到性成熟的3齡中華沙鰍雌性個體，所用中華沙鰍體重范圍為(13±3) g，體長范圍為(11±3) cm。

1.2 組織切片制作和圖像采集

固定后的卵巢組織經(jīng)脫水，石蠟包埋后，制成5～7 μm厚的切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后，中性樹膠封片。采用數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(BA200Digital，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)分別采集100和400倍放大切片圖片，每張切片隨機選取10個視野，觀測每個視野中所有卵母細胞。

1.3 血液生化指標(biāo)檢測

本次實驗共檢測了9項血液生化指標(biāo)，分別為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(CHOL)等血液生化指標(biāo)，以上指標(biāo)均采用全自動生化分析儀(TC6010L，江西特康科技有限公司)進行測定，酶類采用速率法，其他為終點法[20]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

組織切片采用 Image Pro Plus 5.1(MediaCybernetics, Bethesda, MD, USA)圖像分析軟件對各時相的卵母細胞進行觀測。參考前人研究方法，根據(jù)中華沙鰍卵巢的組織學(xué)特征，將卵母細胞分為6個時相[21]。用JMP10.0.2(SAS Institute Inc. Cary, NC)軟件對不同時期的血液生化指標(biāo)檢測數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果采用最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(χ±Sχ)表示，采用Student’ t法進行檢驗，取P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華沙鰍繁殖前期卵巢組織學(xué)特征

繁殖前期卵母細胞呈小葉狀分布，卵母細胞間有毛細血管和結(jié)締組織構(gòu)成的間質(zhì)，以第Ⅱ時相卵母細胞為主，可見少量第Ⅲ時相卵母細胞(圖1A)。第Ⅱ時相卵母細胞直徑約50～110 μm，胞核直徑約11～30 μm，胞體較小，細胞呈圓形或橢圓形，細胞質(zhì)呈嗜堿性反應(yīng)，染色后呈深藍色，胞核明顯，分布在細胞中央，核仁多個，多靠近核膜內(nèi)側(cè)分布；第Ⅲ時相卵母細胞直徑約110～260 μm，胞核平均直徑約70～105 μm，胞體較大，屬于初級卵母細胞的大生長期，細胞質(zhì)為弱嗜堿性，染色后呈粉色，胞質(zhì)內(nèi)靠胞膜邊緣有空泡狀小泡，胞核明顯，多數(shù)第Ⅲ時相細胞胞核位于細胞中央(圖1B)。

A：繁殖前期卵巢，示第Ⅱ、Ⅲ時相卵母細胞，HE，×100；B：繁殖前期卵巢，示細胞核(N)、核仁(Nu)、放射帶(ZR)、濾泡細胞(FC)，HE，×400；C：繁殖期卵巢，示第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ時相卵母細胞、授精孔(FH)，HE，×100；D：繁殖期卵巢，示第Ⅳ時相卵母細胞卵黃顆粒(YG)、放射帶(ZR)，HE，×400；E：繁殖后期卵巢，示第Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ時相卵母細胞，HE，×100；F：繁殖后期卵巢，HE，×400A: Ovarian tissue in pre-spawning stage, showing the phase Ⅱand Ⅲ oocytes, HE. ×100; B: Ovarian tissue in pre-spawning stage, showing the cell nucleus (N), nucleolus (Nu), zona radiata (ZR), follicular cell (FC), HE. ×400; C: Ovarian tissue in spawning stage, showing the phaseⅡ, Ⅲ, Ⅳ, and Ⅴoocytes, fertilization hole (FH), HE. ×100; D: Ovarian tissue in spawning stage, showing the yolk granules (YG) and zona radiata (ZR) of phase Ⅳ oocytes, HE. ×400; E: Ovarian tissue in post-spawning stage, showing the phase Ⅱ, Ⅲ and Ⅵ oocytes, HE. ×100; F: Ovarian tissue in post-spawning stage, HE. ×400圖1 中華沙鰍卵巢組織切片F(xiàn)ig.1 Observation of ovarical histological structure for Sinibotia superciliaris in three breeding stages

2.2 中華沙鰍繁殖期卵巢組織學(xué)特征

繁殖期以第Ⅳ時相卵母細胞為主，可見少數(shù)第Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ時相卵母細胞(圖1C)。第Ⅳ時相卵母細胞為初級卵母細胞大生長期的后階段，即生長成熟階段。細胞體積明顯增大，第Ⅳ時相卵母細胞直徑約570～720 μm。第Ⅳ時相卵母細胞細胞質(zhì)中卵黃不斷積累由細胞的邊緣逐漸向中央擴展，最終充滿整個細胞，而且卵黃顆粒不僅數(shù)量增加，體積也不斷增大，隨著卵母細胞的成熟，構(gòu)成濾泡膜的兩層濾泡細胞更加明顯，并且內(nèi)層濾泡細胞變得比外層濾泡細胞圓而大，放射膜增厚(圖1C、D)。 第Ⅴ時相卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大的卵黃顆粒，體積明顯增大，卵母細胞直徑約700～950 μm。第Ⅴ時相卵母細胞中卵黃顆粒已充滿整個卵母細胞并融合成板塊狀，核膜、核仁均消失，核質(zhì)與動物極胞質(zhì)融合。

2.3 中華沙鰍繁殖后期卵巢組織學(xué)特征

繁殖后期卵巢中以第Ⅱ時相卵母細胞為主，可見少量的第Ⅲ時相和第Ⅵ時相卵母細胞，核周細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡(圖1E)。第Ⅵ時相卵母細胞細胞形狀不規(guī)則，體積變小，濾泡細胞增多、肥大，卵黃潰散、液化，放射膜模糊不清，細胞核消失或處于消失過程中，核膜崩解，卵膜變形、破裂，卵母細胞發(fā)生明顯變形萎縮(圖1F)。

2.4 繁殖過程中血液生化指標(biāo)變化規(guī)律

中華沙鰍繁殖過程中CHOL、TG、ALB等血液生化指標(biāo)呈先上升后降低趨勢，ALP則呈現(xiàn)出先降低后上升的變化趨勢，ALT、GLU、TP、GLO等血液生化指標(biāo)呈逐漸上升趨勢， 而AST則呈逐漸下降的變化趨勢，中華沙鰍繁殖過程中所檢測的各項血液生化指標(biāo)雖然都有所變化，但均未呈現(xiàn)出顯著差異，各項血液生化指標(biāo)測定結(jié)果見表1。

3 討 論

3.1 中華沙鰍繁殖過程中卵巢組織學(xué)特征

關(guān)于魚類性腺發(fā)育分期方法眾多，許多學(xué)者在前蘇聯(lián)學(xué)者B.A.Meйeн(1939)分期方法的基礎(chǔ)上不斷加以改進和完善，根據(jù)卵母細胞的細胞學(xué)特征，將其生長發(fā)育過程分為 6 個時相，其方法、內(nèi)容和名稱日趨一致[21]。因此，本文參考前人研究方法，將中華沙鰍的卵細胞的形成分為 6 個時相，即卵原細胞期、單層濾泡期、卵黃泡期、卵黃充滿期、成熟期和退化期。本試驗發(fā)現(xiàn)中華沙鰍繁殖前期其卵巢內(nèi)卵母細胞以第Ⅱ時相卵母細胞為主，可見少量第Ⅲ時相卵母細胞；繁殖期以第Ⅳ時相卵母細胞為主，可見少數(shù)第Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ時相卵母細胞；繁殖后期卵巢中以第Ⅱ時相和第Ⅲ時相卵母細胞為主，可見少量第Ⅵ時相卵母細胞。在繁殖過程中，中華沙鰍卵母細胞從第Ⅱ時相生長發(fā)育到第Ⅴ時相基本上是同步的，繁殖后期的卵巢以第Ⅱ時相卵母細胞為主，可見排卵后留下來的濾泡膜和結(jié)締組織，有少量未產(chǎn)出的卵母細胞退化后形成的第Ⅵ時相卵母細胞，沒有或很少有次發(fā)性的Ⅲ時相和Ⅳ時相卵母細胞，符合一次性產(chǎn)卵魚類特征，試驗結(jié)果與楊明生等所推測的中華沙鰍為一次性產(chǎn)卵魚類的觀點一致[22]。

表1 中華沙鰍繁殖過程中不同時期血液生化指標(biāo)(最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Table 1 Blood biochemical indices of Sinibotia superciliaris in different stages during the breeding process (χ±Sχ)

已有研究發(fā)現(xiàn)卵徑大小能夠直接影響孵化后魚苗的生長和存活率[23]，因此對魚類繁殖過程中卵徑進行測定和分析具有重要的意義。本試驗檢測結(jié)果顯示中華沙鰍繁殖前期卵母細胞體積逐漸變大，大部分卵母細胞開始由小生長期向營養(yǎng)物質(zhì)儲備的大生長期過渡，發(fā)育至繁殖期大部分的卵母細胞中卵黃顆粒大量沉積，卵母細胞體積顯著增大，而繁殖后期卵巢中未能順利排卵的卵母細胞會退化并被吸收，逐漸出現(xiàn)變形萎縮。中華沙鰍繁殖過程中卵母細胞變化特征與大多數(shù)魚類相似，但不同魚類各時相卵母細胞的大小均有所不同。楊明生等[22]曾在體視顯微鏡下對性腺發(fā)育至 Ⅳ期收集自金沙江流域中華沙鰍卵巢中的1000粒卵的卵徑進行測定，所測定卵徑范圍在200～1400 μm。而本試驗檢測結(jié)果顯示中華沙鰍繁殖過程中卵徑范圍在50～950 μm，卵徑略小于金沙江流域采集的中華沙鰍卵徑，可能是由于實驗采用中華沙鰍的個體大小、生長環(huán)境、養(yǎng)殖方式和性腺發(fā)育程度不同等多種原因?qū)е?。在鰍科魚類中，大鱗副泥鰍第Ⅲ、Ⅵ時相卵母細胞直徑范圍在191～870 μm[24]，長薄鰍第Ⅲ時相到第Ⅴ時相卵母細胞直徑范圍在235～1185 μm[25]，比較發(fā)現(xiàn)中華沙鰍卵母細胞直徑小于同為鰍科魚類的大鱗副泥鰍和長薄鰍。通過對中華沙鰍繁殖過程中卵巢組織學(xué)特征的研究，為其不同時期卵巢發(fā)育特點和卵母細胞卵徑大小提供了參考數(shù)據(jù)

3.2 繁殖過程中血液生化指標(biāo)變化規(guī)律

魚類血液生化指標(biāo)不僅能反映魚類的物種特征及生理狀態(tài)，還能為繁殖和病理研究等提供重要參考依據(jù)[26]。在繁殖過程中，魚類會通過血液生理生化指標(biāo)的改變以適應(yīng)繁殖期間的生理需要，血液生化指標(biāo)對反映動物生理功能正常與否具有重要的指示作用[19]。肝臟是機體代謝和能量產(chǎn)生的重要場所，繁殖期間內(nèi)分泌機能的改變和對能量需求的增加，肝臟功能異常很可能影響魚類卵巢的成熟及排卵活動[27]。肝臟是TP、ALB和GLO合成的主要場所，ALT和AST是目前肝功能檢查常用的重要血清酶學(xué)指標(biāo)，這些血液生化指標(biāo)的變化可以從一定程度上反應(yīng)肝臟的代謝能力[28]，可有效地了解繁殖過程中中華沙鰍的健康狀況。此外，血液生化指標(biāo)的測定還可用于魚類性腺發(fā)育時期的判定，研究表明用ALB/GLO、TP和鈣離子(Ca2+)水平來判斷施氏鱘卵巢發(fā)育階段的判別準(zhǔn)確率可達100 %[29]，而用血液淀粉酶(AMS)、Ca2+、肌酐(CR)和GLU來判斷西伯利亞鱘雌魚性腺發(fā)育時期的判別準(zhǔn)確率也可達100%[20]。

魚類血漿中各類蛋白含量與性腺發(fā)育過程相關(guān)，與卵黃蛋白原的含量存在線性關(guān)系[30]，已有研究發(fā)現(xiàn)ALB水平在西伯利亞鱘性腺發(fā)育和鯔魚繁殖過程中均呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，在產(chǎn)卵前ALB水平達到最高，產(chǎn)卵后ALB水平逐漸下降[20, 31]，本試驗中華沙鰍繁殖過程中ALB也同樣呈現(xiàn)出了先上升后降低趨勢。在施氏鱘卵巢發(fā)育過程中AST/ALT呈顯著下降趨勢，GLU呈先上升后降低趨勢，而ALB和CHOL則呈逐漸上升趨勢[29]，本試驗中華沙鰍繁殖過程中AST/ALT也呈現(xiàn)出了逐漸下降趨勢的變化趨勢，而中華沙鰍繁殖過程中GLU呈逐漸上升趨勢，ALB和CHOL呈先上升后降低趨勢，這與施氏鱘存在一定差異。在中華沙鰍繁殖過程中所檢測的血液生化指標(biāo)雖未呈現(xiàn)出顯著差異，但仍出現(xiàn)了一定變化，可能是由于繁殖期間內(nèi)分泌機能的改變和對能量需求的增加，肝臟的代謝效率也會發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致ALT和AST等指標(biāo)也會隨之發(fā)生變化。此外，魚類在繁殖過程中卵巢發(fā)育所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)主要為脂類物質(zhì)[32]，隨著卵巢發(fā)育對能量需求的增加，機體會將更多的營養(yǎng)物質(zhì)不斷轉(zhuǎn)化為能量以維持自身正常的生理活動，從而導(dǎo)致TP、GLU、CHOL等水平也不斷發(fā)生改變。然而魚類血液生化指標(biāo)不僅受年齡、性別、繁殖和食性等內(nèi)源性因素影響，還會受到餌料、溶氧、溫度、養(yǎng)殖方式和疾病等環(huán)境因子影響[19]，不同種屬魚類繁殖過程中的代謝存在較大差異，血液生化指標(biāo)變化規(guī)律也存在一定差異，中華沙鰍繁殖過程中生化代謝機理還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本文對中華沙鰍繁殖前期、繁殖期和繁殖后期卵巢組織學(xué)特征和血液生化指標(biāo)變化規(guī)律進行了研究，對中華沙鰍繁殖過程中不同時期卵巢內(nèi)卵母細胞組成和發(fā)育變化規(guī)律進行了探討，測定了不同時相的卵母細胞直徑，并對不同時期的ALT、AST、ALP、CHOL、TG、GLU、TP、ALB、GLO等血液生化指標(biāo)變化規(guī)律進行了總結(jié)，該結(jié)果為中華沙鰍繁殖過程中卵母細胞變化規(guī)律、不同時期的卵徑和血液生化指標(biāo)提供參考數(shù)據(jù)，為進一步探究中華沙鰍繁殖過程中的卵巢發(fā)育特點、提高中華沙鰍繁殖力和了解其繁殖期健康狀況提供理論依據(jù)。