霍建飛,郝永娟,楊秀榮,姚玉榮,孫淑琴,劉春艷,王萬(wàn)立

(天津市植物保護(hù)研究所，天津 300384)

【研究意義】番茄是我國(guó)設(shè)施蔬菜中普遍種植的蔬菜，由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、口感好而備受人們喜愛。由于蔬菜大棚種植年限增加以及環(huán)境變化，在番茄上出現(xiàn)了一些新病害。2013年12月在天津市植保所武清創(chuàng)新基地溫室番茄上發(fā)現(xiàn)一種新病害，該病主要危害葉片，嚴(yán)重時(shí)病斑連片，病斑褐色至深褐色，圓形至橢圓型，病斑處下陷，病斑正面具有同心輪紋，該病嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量及質(zhì)量。對(duì)引起該病的病原菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)該菌進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)，篩選高效的化學(xué)藥劑，以期為防治該病害提供理論依據(jù)，對(duì)于田間有效防治該病害具有重要意義。 【前人研究進(jìn)展】目前關(guān)于植物病害鑒定的研究較多，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法已廣泛應(yīng)用于植物病害病原的鑒定，如根腐病菌(Fusariumsporotrichioide)[1]、褐斑病菌(Alternariaalternata)[2]炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)[3-4]，在番茄病害方面，番茄頸腐根腐病[5]、番茄枯萎病[6]、番茄白粉病[7]等也通過形態(tài)學(xué)特征結(jié)合rDNA-ITS 序列分析的方法鑒定出病原菌。在天津市植物保護(hù)研究所武清創(chuàng)新基地大棚中發(fā)現(xiàn)的番茄葉部病害與趙彥杰等[8]于2006-2008年在北京地區(qū)蔬菜種植基地發(fā)現(xiàn)的番茄漆斑病(病原為Myrotheciumroridum)癥狀相似，但是否由M.roridum引起還有待明確。【本研究切入點(diǎn)】本研究采用真菌形態(tài)學(xué)及對(duì)病菌DNA的ITS區(qū)進(jìn)行序列分析相結(jié)合的方法對(duì)引起該病的病原菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，并對(duì)該菌進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)，【擬解決的關(guān)鍵問題】以期篩選出高效的化學(xué)藥劑，為科學(xué)防治該病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試番茄：番茄品種為“天冠”(購(gòu)買于天津市西青區(qū)辛口鎮(zhèn)佳信興農(nóng)農(nóng)資店)， 番茄病葉于2013年12月在天津市植物保護(hù)研究所所武清創(chuàng)新基地溫室中發(fā)現(xiàn)，2013年12月10日采集病葉用于病原的分離鑒定。

供試藥劑：10 %苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)水分散粒劑，東莞市瑞德豐生物科技有限公司；430 g/L戊唑醇(tebuconazole)懸浮劑、41.7 %氟吡菌酰胺(fluopyram)懸浮劑，德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司；80 %多菌靈(carbendazim)可濕性粉劑，河北省化學(xué)工業(yè)研究院；250 g/L吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)乳油、50 %醚菌酯(kresoxim-methyl)水分散粒劑，巴斯夫歐洲公司；250 g/L嘧菌酯(azoxystrobin)懸浮劑，先正達(dá)(蘇州)作物保護(hù)有限公司；德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司(紅字應(yīng)去掉)75 %百菌清(chlorothalonil)可濕性粉劑，江蘇省新沂市科大農(nóng)藥廠；45 %咪鮮胺(prochloraz)水乳劑，北京北農(nóng)天風(fēng)農(nóng)藥有限公司。供試試劑：NaCl，Tris-HCl，EDTA，PVP，CTAB，β-巰基乙醇，氯仿，異戊醇，NaAc，75 %乙醇，瓊脂糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純。Goldview、Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒均為康為世紀(jì)公司生產(chǎn)。培養(yǎng)基： 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，簡(jiǎn)稱PDA)(1L 水中含葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂18 g)。儀器：Eclipse 80i熒光顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；Bio-RAD電泳儀，北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司；Sigma3K15離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；KodakGellogic 2200 凝膠成像儀，Kodak公司；RXZ-280C型人工氣候箱，寧波江南儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離、純化及形態(tài)學(xué)鑒定 在無(wú)菌條件下將病葉病斑剪下用5 %次氯酸鈉溶液表面消毒1～2 min，用無(wú)菌水沖洗3次，置于PDA平板培養(yǎng)基上25 ℃下恒溫培養(yǎng)，約2～3 d長(zhǎng)出菌絲后挑取邊緣菌落進(jìn)行純化。待菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生分生孢子后，將分生孢子挑入滅菌蒸餾水中，配制成濃度約為1.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，用滅菌毛細(xì)管吸取少量孢子懸浮液于PDA平板上，置于25 ℃下培養(yǎng)48 h后觀察培養(yǎng)基上形成的微小菌落，將由單個(gè)孢子形成的微小菌落及周圍培養(yǎng)基一起切下，轉(zhuǎn)入另一PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以獲得該病原菌的單孢純化菌株[9]。

觀察純化的病原菌在PDA平板上的菌絲形態(tài)、顏色、產(chǎn)孢情況及孢子形狀、大小、產(chǎn)孢器、孢子梗等形態(tài)特征。

1.2.2 病原菌的致病性測(cè)定 將純化的菌株挑入PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待其產(chǎn)生分生孢子后將其配制成濃度約為1.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，將其均勻噴施到健康番茄植株(提前在營(yíng)養(yǎng)缽中育好的番茄苗，苗齡約30 d)葉片上，接種后置于人工氣候箱中培養(yǎng)(白天14 h，溫度25 ℃，相對(duì)濕度95 %；夜間10 h，22 ℃，相對(duì)濕度90 %)，觀察并記錄發(fā)病情況。待其發(fā)病后再次分離病原菌，并與原接種菌株進(jìn)行比較。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 采用易潤(rùn)華等[10]的CTAB法提取病原菌DNA。用滅菌的牙簽挑取50 mg左右新鮮菌絲于研缽中，加600 μl CTAB提取緩沖液(含0.7 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，20 mmol/L EDTA，10 g/LPVP，20 g/LCTAB，0.1 %β-巰基乙醇)，充分研磨后移入1.5 mL的Eppendorf管中，于水浴鍋中65 ℃下保溫30 min，加等體積氯仿/異戊醇混合液[V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1]充分搖勻，4 ℃下10 000 r/min離心5 min。移取上清液至新的Eppendorf管中，加10 %體積的3 mol/L pH 6.0 NaAc溶液和2.5倍體積的冰凍乙醇，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，棄上清液，用70 %的酒精洗2～3次，晾干，加TE緩沖液(含10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L pH 8.0 EDTA)充分溶解后，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR引物為真菌核糖體DNA(rDNA)的ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4，引物序列(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成如下：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR體系為50 μl：25 μl Mixture混合液，100 ng/μl模板DNA 2 μl，10 μmol/L引物ITS1 和ITS4各2 μl，ddH2O 19 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性45 s，56 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸 45 s，共 35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，置4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物在1.2 %瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL Goldview) 中電泳，凝膠成像儀上照相并保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒回收純化后委托金唯智生物科技有限公司進(jìn)行克隆及測(cè)序。

1.2.4 病原菌室內(nèi)藥劑篩選 采用平皿法[11]測(cè)定不同藥劑對(duì)番茄油漆斑病菌的抑菌率。供試藥劑(1.1材料中的供試藥劑)直接用水溶解稀釋，根據(jù)藥劑活性，各藥劑設(shè)置的系列質(zhì)量濃度不同(10 %苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑設(shè)置濃度分別為200、100、50、10、1、0.1 μg/mL；430 g/L戊唑醇懸浮劑設(shè)置濃度分別為200、100、50、10、1、0.1 μg/mL；41.7 %氟吡菌酰胺(懸浮劑設(shè)置濃度分別為10、1、0.5、0.1、0.01 μg/mL；80 %多菌靈可濕性粉劑設(shè)置濃度分別為10、5、1、0.1、0.01 μg/mL；250 g/L吡唑醚菌酯乳油設(shè)置濃度分別為100、50、10、1、0.1、0.01 μg/mL；50 %醚菌酯水分散粒劑設(shè)置濃度分別為100、50、10、1、0.1、0.01 μg/mL；250 g/L嘧菌酯懸浮劑設(shè)置濃度分別為100、50、10、1、0.1、0.01 μg/mL；75 %百菌清可濕性粉劑設(shè)置濃度分別為200、100、50、10、1 μg/mL；45 %咪鮮胺水乳劑設(shè)置濃度分別為100、50、10、1、0.1 μg/mL)。在無(wú)菌操作下，根據(jù)試驗(yàn)處理吸取預(yù)先融化的滅菌培養(yǎng)基36 mL加入到無(wú)菌50 mL三角瓶中，從低濃度到高濃度依次吸取4 mL藥液，分別加入上述三角瓶中，充分搖勻。然后等量倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中(直徑為9 cm)，制成相應(yīng)濃度的含藥平板。設(shè)不含藥劑的處理作為空白對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

將培養(yǎng)好的病原菌在無(wú)菌條件下用滅菌打孔器(直徑為3 mm)在菌落邊緣切取菌餅，用接種器將菌餅接種于含藥平板中央，菌絲面朝上，蓋上皿蓋，置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后，用卡尺測(cè)量菌落直徑，每個(gè)菌落用十字交叉法垂直測(cè)量直徑各1次，取其平均值，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。計(jì)算各藥劑對(duì)番茄漆斑病菌的抑菌率 ，利用SPSS19.0軟件計(jì)算EC50、EC90及毒力回歸方程。抑菌率= (空白對(duì)照菌落半徑-藥劑處理菌落半徑 )/空白對(duì)照菌落半徑×100 %。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀、病原菌的分離純化及形態(tài)學(xué)特征

該病斑褐色或深褐色，橢圓形至圓形，病斑處下陷，有的病斑周圍具有黃色暈圈，病斑正面具有同心輪紋(圖1-a)；經(jīng)分離培養(yǎng)該菌在PDA平板上形成的菌落顏色初為白色，絨毛狀，26 ℃下培養(yǎng)5 d以后開始產(chǎn)生黑色或墨綠色的油漆狀分生孢子堆(圖1-b)，菌落背面為淡黃色(圖1-c)；分生孢子座淺杯狀，無(wú)剛毛(圖1-d)，分生孢子梗叢生，帚狀(圖1-e)，分生孢子單胞，桿狀，無(wú)色，兩端各有1～2個(gè)小油球，PDA平板培養(yǎng)狀態(tài)下孢子大小為 (6.33～9.00) μm×(1.28～2.33) μm(圖1-f)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，該病菌初步鑒定為露濕漆斑菌Myrotheciuroridum

a：番茄漆斑病典型病斑； b：PDA平板培養(yǎng)的正面菌落；c：PDA平板培養(yǎng)的背面菌落； d：分生孢子座；e：分生孢子梗；f：分生孢子a: Typical lesions on tomato leaves; b: Positive mycelium colony cultured on the PDA plate; c: Reverse mycelium colony cultured on the PDA plate; d: Sporodochium; e: Conidiophores; f: Conidiospores圖1 番茄漆斑病癥狀及病原菌的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Symptom s of tomato myrothecium leaf spot and morphological characteristics of Myrothecium roridum

a：病原菌回接番茄葉片癥狀；b：病原菌回接番茄莖癥狀；c：病原菌回接番茄葉片后分離的病原菌a: Symptom developed on tomato leaf by artificial inoculation; b: Symptom developed on tomato stem by artificial inoculation; c: Pathogen mycelium colony isolated from inoculated tomato leaves圖2 病原菌回接番茄后癥狀及分離的病原菌Fig.2 Symptom on tomato leaves by artificial inoculation and pathogen isolated from inoculated tomato leaves

2.2 病原菌致病性測(cè)定

將分離得到的病原菌孢子懸浮液噴施于健康植株番茄葉片及莖上，6 d后葉片的病斑癥狀與田間發(fā)病癥狀(圖1-a)相似，且番茄莖上也出現(xiàn)凹陷病斑(圖2-b)；從接種發(fā)病的植株葉片及莖上分離的病原菌與前期接種菌株培養(yǎng)性狀相同(圖2-c)，根據(jù)柯赫氏法則，接種的病原菌即為從田間番茄葉片上分離純化的病原菌。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

使用真菌核糖體DNA的18S區(qū)域引物ITS1和ITS4擴(kuò)增出了大小為600 bp左右的片段(圖3)，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序后拼接，獲得該病原菌的最終ITS序列。將該序列輸入NCBI中進(jìn)行nucleotide blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示，該序列與NCBI庫(kù)中的露濕漆斑菌(GenBank登錄號(hào)為AB823653.1和EU927366.1)同源性達(dá)到99 %，綜合形態(tài)學(xué)特征確定該致病菌為露濕漆斑菌M.roridum。

M：DL2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；S：分離的病原菌 M: DL2000 DNA marker; S: Isolated fungi圖3 分離的病原菌PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 Electrophoretogram of PCR products of isolated fungi on tomato leaf

2.4 室內(nèi)藥劑篩選

氟吡菌酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯和多菌靈對(duì)番茄漆斑菌菌絲的抑菌作用很強(qiáng)，其EC50分別為0.094、0.781、1.041和1.396 μg/mL；醚菌酯、咪鮮胺水乳劑對(duì)番茄漆斑菌菌絲的抑菌作用較強(qiáng)，其EC50分別為4.936和8.479 μg/mL；戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑?qū)z的抑制作用略差，其EC50分別為16.018和21.584 μg/mL；百菌清對(duì)病原菌的抑菌活性最差，其EC50大于100，基本無(wú)活性(表1)。

室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)表明，在氟吡菌酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯和多菌靈等4種抑菌活性較好的殺菌劑中，氟吡菌酰胺的EC50和EC90均最小，表明氟吡菌酰胺對(duì)番茄漆斑病菌菌絲的抑制能力最強(qiáng)；雖然多菌靈的EC50大于嘧菌酯及吡唑醚菌酯，但其EC90(2.057 μg/mL)遠(yuǎn)小于嘧菌酯SC(EC90>100)和吡唑醚菌酯(EC90為77.287)，這說明多菌靈對(duì)番茄漆斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌活性大于嘧菌酯和吡唑醚菌酯。

3 結(jié)論與討論

目前，隨著環(huán)境變化，植物上出現(xiàn)了一些新病害。由露濕漆斑菌引起的番茄漆斑病(也稱漆腐病)最早是由Stevenson & McCollochL于1947年在美國(guó)德克薩斯州的番茄果實(shí)上首次發(fā)現(xiàn)[12]，隨后有報(bào)道稱，該菌可引起番茄果實(shí)腐爛[13-14]。而國(guó)內(nèi)由露濕漆斑菌引起的植物病害的相關(guān)報(bào)道較少，堵鶴鳴等在1988年首次發(fā)現(xiàn)該菌可引起桑樹漆斑病[15]，2009年賁海燕等[16]對(duì)引起瑞典常春藤(Pelctranthusoertendahlii)漆斑病的病原鑒定，確定病原為露濕漆斑菌。李寶聚和趙彥杰[17]在山東青州、北京大興以及遼寧海城等溫室茄子種植區(qū)，發(fā)現(xiàn)有茄子漆斑病發(fā)生，并將其病原鑒定為露濕漆斑菌。近兩年來陸續(xù)有報(bào)導(dǎo)該菌可引起山藥漆腐葉斑病[18]

表1 9種殺菌劑對(duì)番茄漆斑病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定Table 1 Determination of the virulence of nine fungicides to Myrothecium roridum in vitro

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差/標(biāo)準(zhǔn)誤。
Note : Data in the table are mean±SD/SE.

和鐵皮石斛漆斑病[19]。而在我國(guó)由露濕漆斑菌引起的番茄漆斑病自趙彥杰等[8]在2009年報(bào)道以后，還未有其它報(bào)道，本試驗(yàn)中番茄漆斑病的癥狀及病原菌形態(tài)學(xué)特征與趙彥杰等[8]所做試驗(yàn)結(jié)果相一致。

吡唑醚菌酯、嘧菌酯和醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[20]，通過阻止細(xì)胞色素bc1復(fù)合物中的電子傳遞而阻止ATP的合成，抑制真菌細(xì)胞中能量產(chǎn)生，干擾呼吸從而達(dá)到抑制真菌孢子萌發(fā)或菌絲生長(zhǎng)[21-22]。本試驗(yàn)中吡唑醚菌酯和嘧菌酯的EC50較小，對(duì)番茄漆斑病菌菌絲的抑制率好于醚菌酯，可以作為番茄漆斑病防治藥劑，至于番茄漆斑病菌菌絲為何對(duì)醚菌酯不敏感，還有待于進(jìn)一步研究；多菌靈是苯并咪唑類殺菌劑，從20世紀(jì)60 年代開始廣泛用于防治植物病害，該類藥物的作用機(jī)制主要是與病原菌的微管蛋白結(jié)合，從而阻礙病菌的有絲分裂[23]，雖然多菌靈用藥歷史悠久，長(zhǎng)期使用病原菌易產(chǎn)生抗藥性[24-25]，但其具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于防治新病害或病害防治初期可以嘗試使用；氟吡菌酰胺是一種新型吡啶基乙基苯甲酰胺類殺菌劑，通過阻礙呼吸鏈中琥珀酸脫氫酶的電子轉(zhuǎn)移而抑制線粒體呼吸[26]，氟吡菌酰胺可用于防治70多種作物上的病害，F(xiàn)ought et al.[27]和Klages et al.[28]證實(shí)氟吡菌酰胺對(duì)核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、灰霉病菌(Botrytiscinerea)、叢梗孢屬病菌(Monilia)和白粉病菌(Erysiphe)所引起的病害防效優(yōu)異，而在我國(guó)陳彥等[29]證實(shí)氟吡菌酰胺對(duì)黃瓜、草莓白粉病防效達(dá)90 %以上，對(duì)甜瓜白粉病的防效達(dá)95 % 以上，而本試驗(yàn)中氟吡菌酰胺對(duì)番茄漆斑病菌的EC50為0.094 μg/mL，而其EC90僅為0.627 μg/mL，說明氟吡菌酰胺對(duì)番茄漆斑病菌的抑菌活性很高。因此，氟吡菌酰胺可以作為番茄漆斑病的有效防治藥劑。

殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定應(yīng)該使用原藥進(jìn)行試驗(yàn)，因?qū)嶒?yàn)室中缺乏部分原藥，為了保證試驗(yàn)的一致性，本試驗(yàn)中的藥品采用制劑代替，雖然并不能完全反映出藥劑對(duì)露濕漆斑菌菌絲的抑制作用，但也能反映出藥劑本身對(duì)露濕漆斑菌菌絲的抑制趨勢(shì)。由于本試驗(yàn)番茄漆斑病菌藥劑篩選試驗(yàn)是在室內(nèi)進(jìn)行，因此在應(yīng)用到田間生產(chǎn)之前，需進(jìn)一步開展田間藥效試驗(yàn)來驗(yàn)證藥劑對(duì)病害的防治效果，還要考慮藥劑對(duì)植物和環(huán)境的影響、成本及抗藥性等諸多因素，力求合理高效地使用殺菌劑。