李菲菲，張凡凡，王旭哲，苗芳，馬春暉

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子832000)

玉米(Zea mays)青貯作為反芻家畜的基礎(chǔ)日糧，其營養(yǎng)品質(zhì)佳、發(fā)酵特性好且儲藏時間長，是當(dāng)今世界最為重要的反芻動物飼料源之一。當(dāng)前，為提高玉米青貯的發(fā)酵特性與營養(yǎng)品質(zhì)，國內(nèi)外玉米青貯調(diào)制的常用方法主要利用各類微生物制劑，其中乳酸菌菌劑作為最為安全有效的添加劑常被應(yīng)用于各類青貯飼料的發(fā)酵[1]。乳酸菌制劑是指多用于飼草青貯的一類乳酸菌添加劑，其主要目的是調(diào)節(jié)青貯原料中的微生物區(qū)系，加快發(fā)酵進(jìn)程，促進(jìn)乳酸的產(chǎn)生以降低p H值，抑制有害微生物的生長增殖從而保存青貯料的營養(yǎng)成分[2]。此外，青貯飼料中添加乳酸菌制劑能夠軟化青貯原料纖維，提高反芻動物的消化率，并增強青貯飼料的適口性[3]。目前，乳酸菌按照發(fā)酵類型可分為同型發(fā)酵和異型發(fā)酵乳酸菌，同型發(fā)酵乳酸菌如植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、糞鏈球菌(Enterococcusfaecium)和戊糖片球菌(Pediococcus acidilactici)等[4];異型發(fā)酵乳酸菌如短乳桿菌(Lactobacillus breris)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)等[5]。其中同型發(fā)酵乳酸菌消耗能量低，能迅速降低青貯飼料的p H，然而其發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸含量較低，不能有效抑制霉菌和酵母菌等的生長，從而造成青貯飼料的腐敗和諸多負(fù)面影響[6-8]。異型發(fā)酵乳酸菌雖然消耗底物的能量較多，但其可產(chǎn)生大量抑制真菌生長的乙酸，從而提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，并可有效防止二次發(fā)酵，通過此過程可彌補發(fā)酵造成的潛在營養(yǎng)損失[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，添加植物乳桿菌可顯著提高玉米青貯干物質(zhì)的快速降解部分，降低全株玉米青貯料中的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，顯著增加其主要營養(yǎng)成分的瘤胃有效降解率。添加布氏乳桿菌可顯著降低酵母數(shù)量提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性。所以控制青貯中同/異型發(fā)酵乳酸菌的種類、比例和發(fā)酵量可能是造成其是否有影響的關(guān)鍵因素[12-14]，而對于其營養(yǎng)成分的影響是否會改善反芻家畜的消化率，是本研究的重點。針對此，本研究以全株玉米青貯為研究對象，探究不同發(fā)酵類型乳酸菌制劑對全株玉米青貯發(fā)酵營養(yǎng)成分及其瘤胃降解率的影響，旨在提高全株玉米青貯的實際營養(yǎng)價值，篩選改善效果較好的乳酸菌制劑，為青貯玉米飼料的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)提供指導(dǎo)，并為我國乳酸菌發(fā)酵菌劑的自主研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗以新疆農(nóng)墾科學(xué)院選育的新飼玉10號(Zea mays cv.‘Xingsiyu NO.10’)飼用玉米為研究材料，試驗地位于新疆石河子大學(xué)牧草實驗站(N 44°20′E，88°30′，海拔420 m)，當(dāng)?shù)貫榈湫偷拇箨懶愿珊禋夂?。前茬作物為棉?Gossypium spp.)。青貯玉米種植時間為2016年4月12日-2016年8月22日(生長期為112 d)，玉米種植為穴播，密度按照寬窄行處理，種植面積為1050 m2，灌水方式采用滴灌，按照一般青貯玉米種植管理模式進(jìn)行管理。在青貯玉米進(jìn)入乳熟末期至蠟熟初期(玉米乳線超過2/3)時進(jìn)行全株刈割，當(dāng)場粉碎至2 cm左右長度。立刻進(jìn)行真空袋法調(diào)制青貯(真空袋規(guī)格40 cm×50 cm)。

青貯乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)添加劑為:同型發(fā)酵LAB:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum，ACCC 11016)和戊糖片球菌(Pediococcus acidilactici，ACCC 05481)，購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)。異型發(fā)酵LAB:布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri，CICC 20293)，菌種購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)計4種處理，Ⅰ、同型發(fā)酵LAB處理(T處理):植物乳桿菌和戊糖片球菌復(fù)合添加，添加量為1∶1，1×105cfu·g-1;Ⅱ、異型發(fā)酵LAB(Y處理):布氏乳桿菌，添加量為1×105cfu·g-1;Ⅲ、同型+異型發(fā)酵LAB(TY處理):植物乳桿菌、戊糖片球菌和布氏乳桿菌，添加量為1∶1∶1，1×105cfu·g-1;Ⅳ、不加任何菌劑對照(CK處理)。各種LAB在MRS液體培養(yǎng)基(主要成分)中富集培養(yǎng)，通過平板計數(shù)后確定數(shù)量，按比例配置好后，用滅菌噴壺均勻的噴灑至待貯玉米表面(CK處理噴灑等量的去離子水)。噴灑完畢后立刻進(jìn)行青貯。青貯共調(diào)制16袋(每個處理4袋)，每袋2 kg，實驗室環(huán)境(23～30℃)下發(fā)酵60 d。在第60天時開袋，從各青貯樣品中隨機挑選3袋測定各處理的營養(yǎng)成分及其反芻動物瘤胃消化率。

1.3 指標(biāo)分析方法

營養(yǎng)成分主要測定干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、粗脂肪(ether extract，EE)、粗灰分(crude ash，Ash)和淀粉(starch，Sta)。各指標(biāo)均按照國標(biāo)進(jìn)行測定[15-18]，其中采用重量法測定DM，采用凱氏定氮法測定CP，采用蒽酮-硫酸比色法測定WSC，采用范氏(Van Soest)洗滌纖維法測定NDF和ADF，采用索氏浸提法(乙醚浸出法)測定EE，采用灰化法測定Ash，采用酶水解法測定Sta。

采用瘤胃瘺管尼龍袋法分析玉米青貯營養(yǎng)成分瘤胃消化率[15]。選用3只體重體型相似[(52±2.5)kg]生長狀況良好的哈薩克羊，安裝永久性瘤胃瘺管。安裝瘺管后正常飼喂1個月，期間檢查安裝瘺管羊的適應(yīng)情況。試驗前采用青貯玉米飼料預(yù)飼一周，每只羊每天定量飼喂200 g精料(由天康公司提供:精料成分為玉米51%、麩皮24%、豆粕18%、尿素1.5%、食鹽1%、碳酸氫鈣2.5%、添加劑2%)，青貯玉米1.8 kg，自由飲水。試驗開始后將各處理樣品再次干燥(65℃)至恒定過篩(69μm)，準(zhǔn)確稱取3 g樣品(±0.01 g)放入尼龍袋中(尺寸6 cm×9 cm，孔徑40～50μm)，填裝后用尼龍線扎口綁在鐵鏈上。于晨飼前(8:00)進(jìn)行投放，共設(shè)置5個時間點(12、24、36、48、72 h)，到相應(yīng)時間后將尼龍袋取出迅速洗凈測定DM、NDF、ADF和有機物(organic matter，OM)含量，OM含量為:OM%=1-Ash%(即:有機物含量=1-無機物含量)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

青貯玉米瘤胃降解率計算方法為(1)式[19]，降解特征參數(shù)計算為(2、3)式[20]:

式中:Dx為待測青貯玉米某成分的瘤胃降解率(%);Ma為待測青貯料青貯玉米某成分含量(g);Mb為過瘤胃殘留物中某成分含量(g);Dp為青貯玉米中某成分在瘤胃內(nèi)停留時間t(h)的瘤胃降解效率，A為快速降解部分(rapid degradation，%)，B為慢速降解部分(slow degradation，%)，A+B為潛在降解部分(potential degradation，%)，C為慢速降解部分的降解速率(B degradation rate，%·h-1)，ED為某成分在瘤胃內(nèi)的有效降解率(effective degradation rate)，k為粗飼料瘤胃外流速率常數(shù)(%·h-1)，本研究k值取4.5%·h-1。采用Matlab軟件進(jìn)行偏最小二乘計算，求得各相關(guān)參數(shù)。

利用公式(1～3)折算成對應(yīng)指標(biāo)降解率(degradation)，即干物質(zhì)降解率(dry matter degradation，DMD)、中性洗滌纖維降解率(neutral detergent fiber degradation，NDFD)、酸性洗滌纖維降解率(acid detergent fiber degradation，ADFD)、有機物降解率(organic matter degradation，OMD)。采用Excel 2007軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的初步整理，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的F檢驗，當(dāng)通過F檢驗后進(jìn)行單因素(One-way ANOVA)和雙因素(Two-way ANOVA)方差分析，通過單因素方差分析計算不同處理間差異性，雙因素方差分析計算發(fā)酵60 d和處理兩個因素及其交互作用影響的顯著性，多重比較方法均采用Duncan法。采用隸屬函數(shù)評價法評價出最佳處理[21]，具體公式為:

式中:X為樣品各指標(biāo)測定值;UX(+)為各指標(biāo)呈正相關(guān)隸屬函數(shù)值;UX(-)為各指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌處理對玉米青貯各營養(yǎng)成分含量的影響

如表1所示，全株玉米青貯原料DM含量為40.36%，CP含量為8.26%，Sta含量為29.83%，NDF含量為47.98%，ADF含量為31.32%，WSC含量為22.01%，Ash含量為9.26%，EE含量為7.58%。青貯發(fā)酵60 d時，各處理營養(yǎng)成分與青貯原料間存在一定差異，其中僅Ash和EE略高于青貯原料，其余營養(yǎng)指標(biāo)均低于青貯原料。各處理間在營養(yǎng)指標(biāo)上有顯著差異(P＜0.05)，其中DM含量按高低排序為Y處理＞T、TY處理＞CK處理(P＜0.001)，CP和Sta含量各試驗處理均極顯著高于CK處理(P＜0.01)，NDF含量按優(yōu)劣排序為Y處理＞T處理＞TY處理＞CK處理(P＜0.001)，ADF含量按優(yōu)劣排序為Y處理＞TY處理＞T處理＞CK處理(P＜0.001)，WSC和EE含量按高低排序均為Y處理＞TY處理＞T處理＞CK處理(P＜0.001)，Ash含量按高低排序為CK處理＞T處理＞Y處理(P=0.009)，而T、Y處理與TY處理間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 不同處理對玉米青貯營養(yǎng)成分的影響Table 1 Effects of different treatments on nutritional quality of plant corn silage

2.2 不同乳酸菌處理對瘤胃降解率的影響

如表2所示，瘤胃中12 h時，Y處理DMD、NDFD和OMD最高(P＜0.05)，ADFD最高為CK和T處理，其二者之間差異不顯著(P＞0.05)，T和Y處理間差異也不顯著(P＞0.05)。瘤胃中24 h時，DMD最高的為CK和T處理，二者顯著高于其余處理(P＜0.05)，NDFD和OMD最高的均為Y處理(P＜0.05)，ADFD最高的為Y處理，其顯著高于CK和T處理(P＜0.05)，但較TY處理差異不顯著(P＞0.05)。瘤胃中36 h時，DMD最高的為T和Y處理，二者顯著高于其他處理(P＜0.05)，NDFD、ADFD和OMD最高的均為Y處理，其顯著高于其余處理(P＜0.05)。瘤胃中48 h時，各指標(biāo)最高的均為Y處理，其顯著高于其余各個處理(P＜0.05)，僅ADFD中Y和TY處理差異不顯著(P＞0.05)。瘤胃中72 h時，各指標(biāo)最高的均為Y處理，其顯著高于其余各個處理(P＜0.05)。雙因素方差分析結(jié)果表明，處理(M)、時間(H)以及M和H的交互作用(M×H)對各指標(biāo)均有極顯著的影響(P＜0.01)。

2.3 不同乳酸菌處理對玉米青貯各營養(yǎng)成分瘤胃降解參數(shù)的影響

通過對玉米青貯各營養(yǎng)成分(DM、NDF、ADF、OM)在瘤胃中的降解模型特征參數(shù)分析，結(jié)果表明(表3)，各營養(yǎng)成分基本含量同開窖60 d時的情況(表1)，其中DM降解參數(shù)中，CK和Y處理快速降解部分(A)顯著高于T和TY處理(P=0.021);CK處理慢速降解部分(B)和潛在降解部分(A+B)顯著高于其余各處理(P＜0.05);B的降解速率(C)最高的為T處理，其顯著高于其余各處理(P＜0.05)，CK處理顯著高于TY處理(P＜0.05)，Y處理與CK和TY處理差異不顯著(P＞0.05);DM有效降解率，T和Y處理顯著高于CK和TY處理(P=0.007)。NDF降解參數(shù)中，T和Y處理下A顯著高于CK和TY處理(P=0.027);各處理下B和A+B按大小排序為，TY處理＞Y處理＞T處理＞CK處理(P＜0.05);各處理之間C的差異不顯著(P=0.227);NDF有效降解率，T和Y處理顯著高于CK和TY處理(P=0.009)。ADF降解參數(shù)中，T和Y處理下A顯著高于CK和TY處理(P=0.006);各處理B、A+B、C和ADF有效降解率之間差異均不顯著(P＞0.05)。OM降解參數(shù)中，Y處理A顯著高于其余處理(P＜0.05)，CK處理A顯著高于T處理(P＜0.05)，而TY處理下A較CK和T處理差異均不顯著(P＞0.05);CK和Y處理下B顯著高于T處理(P＜0.05)，但較TY處理相比差異不顯著(P＞0.05)，且T和TY處理間差異不顯著(P＞0.05);A+B按大小排序為CK和Y處理＞T和TY處理(P=0.027);Y處理C與T處理相比差異不顯著(P＞0.05)，但顯著高于CK和TY處理(P＜0.05)，T處理與CK和TY處理間差異均不顯著(P＞0.05);OM有效降解率，Y處理顯著高于其余各處理(P=0.003)。

表2 不同處理對玉米青貯瘤胃降解率的影響Table 2 Effects of different treatments on rumen regeneration of plant corn silage(%)

表3 不同處理玉米青貯瘤胃中各指標(biāo)的降解率和降解參數(shù)Table 3 The digestibility and digestibility coefficients of corn silage with different treatments

2.4 不同乳酸菌處理玉米青貯各指標(biāo)的綜合價值評價

由于各處理在不同指標(biāo)上表現(xiàn)均不相同，而以任何一個單一指標(biāo)評價最佳發(fā)酵處理均是不全面的[21]。因此，對12項營養(yǎng)成分和瘤胃降解率特征指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，其中NDF、ADF為負(fù)向指標(biāo)(即含量越高質(zhì)量越差)，其余均為正向指標(biāo)。隸屬函數(shù)值綜合價值評價中，平均值越大綜合價值越高，各處理綜合價值按高低排序為:Y處理(0.76)＞T處理(0.62)＞TY處理(0.37)＞CK處理(0.16)(表4)。

3 討論

3.1 同/異質(zhì)型乳酸菌添加對玉米青貯營養(yǎng)指標(biāo)的影響

青貯的營養(yǎng)成分是評價青貯飼料最為直接的指標(biāo)。其中DM含量作為青貯玉米底物營養(yǎng)成分的基礎(chǔ)尤為重要。以往研究表明，青貯玉米中添加乳酸菌菌劑均可顯著提高DM含量[4]，且接種布氏乳桿菌在提高不帶穗玉米秸稈青貯的DM含量方面最為有效[12]，本研究中加入各種乳酸菌處理的DM含量也顯著高于不加菌劑處理，且其中添加布氏乳桿菌(Y處理)提高DM含量最為顯著，這證實了以往研究論點。開窖時CP含量較發(fā)酵前相比均有所下降，而添加乳酸菌處理均顯著高于不加菌劑處理，其原因主要為青貯發(fā)酵過程是多種微生物參與的體系，在各類微生物(好氧/厭氧)的共同作用下，底物中蛋白物質(zhì)被大量消耗，轉(zhuǎn)化成氨態(tài)氮和胺類物質(zhì);但由于外源添加的乳酸菌在發(fā)酵過程中占主導(dǎo)地位，其一方面降低了蛋白向氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化的效率(即降低氨態(tài)氮含量)[8-9];另一方面，其繁殖產(chǎn)生的菌體蛋白可增加青貯體系的蛋白含量[22]。此外，有學(xué)者在不同干物質(zhì)含量的苜蓿(Medicago sativa)青貯中接種乳酸菌也得到了相同的結(jié)論[23]。添加各乳酸菌處理均提高青貯體系Sta含量，其說明乳酸菌有利于提高青貯體系Sta含量，同時也佐證了添加不同發(fā)酵類型乳酸菌青貯可顯著提高奶牛奶產(chǎn)量(Sta含量與奶產(chǎn)量呈正相關(guān))[4，22]。有學(xué)者在大麥(Hordeum vulgare)、桑葉(Morus alba)和全株青貯玉米中添加不同發(fā)酵類型乳酸菌，結(jié)果表明NDF和ADF含量均顯著下降[23-26]，本研究得到相同結(jié)論。另外本研究表明布氏乳桿菌在降低NDF和ADF含量方面效果最為顯著，原因可能是布氏乳桿菌的繁殖產(chǎn)生阿魏酸酯酶(feruloyl esterase，F(xiàn)E)，其可水解木質(zhì)素和半纖維素之間的阿魏酸酯鍵，破壞纖維結(jié)構(gòu)，從而降低纖維的含量，并在一定程度上改善飼料的纖維可消化性[27]。對于本研究中Ash和EE含量發(fā)酵前后的變化規(guī)律，與苗芳等[21]得到的試驗結(jié)果相似，而產(chǎn)生這一規(guī)律的原因目前還尚未明確[28]，有待繼續(xù)探索。

表4 各處理全株玉米青貯隸屬函數(shù)分析及綜合價值排序Table 4 Analysis and comprehensive value rank withdifferent treatments on the membership function of all silage corn

3.2 同/異質(zhì)型乳酸菌添加對綿羊瘤胃降解率的影響

反芻動物對粗纖維的消化利用主要是通過瘤胃中微生物的降解來進(jìn)行的，測定NDF和ADF的表觀消化率，能在一定程度上反映出瘤胃微生物對纖維的消化降解情況。有研究發(fā)現(xiàn)豌豆(Pisum sativum)和小麥(Triticum aestivum)青貯中添加布氏乳桿菌提高了瘤胃氮降解營養(yǎng)成分的能力和NDFD，但不顯著影響ADFD和DMD[29-30]，本研究得到相似結(jié)論，NDFD隨瘤胃停留時間的延長(12～72 h)逐漸升高，此外本研究中DMD、OMD也隨瘤胃停留時間的延長逐漸升高，這與Aksu等[30]研究結(jié)果相同。另有研究對稻貯中添加微生態(tài)制劑(乳酸菌)，其較不添加相比DMD、ADFD和NDFD隨之升高[31]，本研究也得到了相同的結(jié)果。所以對于青貯底物(飼草)、乳酸菌(不同發(fā)酵類型)接種劑量以及發(fā)酵時間的不同均可導(dǎo)致瘤胃降解率產(chǎn)生很大變化。另外，有研究表明在不同菜渣青貯中添加植物乳桿菌后，僅有部分菜渣體外消化率有所升高[32]，其在證實了上述猜測的同時，也表明并不是所有作物或農(nóng)副產(chǎn)品均適宜青貯發(fā)酵，控制發(fā)酵底物的含水量和營養(yǎng)成分比例可能是導(dǎo)致出現(xiàn)不同結(jié)果的主要原因。此外，微生物尤其是乳酸菌在發(fā)酵體系中的作用規(guī)律不容忽視，在青貯飼料發(fā)酵初期片球菌起著非常重要的作用，植物原料在收獲制作成青貯飼料后，最先進(jìn)行發(fā)酵的是糞鏈球菌和腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，接著被更耐酸的菌株，如植物乳桿菌、短乳桿菌、布氏乳桿菌等取代[33]。本試驗中ADFD和NDFD均顯著增加，另一個主要的方面是利用乳酸菌制劑處理后，青貯過程中的乳酸菌數(shù)量顯著增加，發(fā)酵速度加快，產(chǎn)生大量的乳酸，降低青貯料的p H值，進(jìn)而抑制有害微生物的活性，提高其營養(yǎng)成分在瘤胃內(nèi)的有效降解率，使得處理后的全株玉米青貯向瘤胃微生物提供更多可溶性的營養(yǎng)成分[34]。瘤胃內(nèi)環(huán)境作為一個相對繁瑣的微生物系統(tǒng)，其中多種微生物和因素發(fā)揮著重要作用，需要繼續(xù)深入研究來更好地掌握乳酸菌添加劑對反芻動物的益生菌效應(yīng)[22]。

4 結(jié)論

本研究得到以下結(jié)論:1)玉米青貯中單獨添加布氏乳桿菌可顯著增加開窖60 d時DM、CP、Sta、NDF、ADF、WSC和EE含量。2)DMD、ADFD、NDFD、OMD隨瘤胃降解時間的延長顯著提高，瘤胃降解時間、不同試驗處理以及其交互作用均極顯著影響各指標(biāo)變化。添加布氏乳桿菌顯著提高DM和OM有效降解率，植物乳桿菌、戊糖片球菌和布氏乳桿菌復(fù)合添加顯著提高NDF有效降解率。3)結(jié)合營養(yǎng)成分和有效降解率等12項參數(shù)指標(biāo)綜合評價各試驗處理，最佳添加處理為單獨添加布氏乳桿菌，添加量為1×105cfu·g-1。