楊成德，崔月貞，馮中紅，薛莉，金夢(mèng)軍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070;2.甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070)

植物內(nèi)生細(xì)菌(Endophytic bacteria)不僅將植物作為其棲息場(chǎng)所，也能通過合成或促使植物合成如生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等多種植物生長(zhǎng)激素促進(jìn)根系吸收水分和養(yǎng)分從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)[1]，如秦娟娟等[2]報(bào)道，經(jīng)內(nèi)生細(xì)菌處理的辣椒(Capsicum annuum)株高、根長(zhǎng)、鮮重和干重均顯著高于對(duì)照，其中干重增加率為109.03%～140.63%，張芳芳等[3]報(bào)道內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物株高和根長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用;另外，內(nèi)生細(xì)菌主要通過影響宿主植物的物質(zhì)代謝，形成生理活性物質(zhì)來改變植株的生理特性，從而提高植物的抗逆性，如Bin等[4]報(bào)道在禾本科植物芒草(Miscanthus sinensis)上接種內(nèi)生固氮菌能減少鹽脅迫的傷害，提高芒草的耐鹽性;羅達(dá)等[5]報(bào)道接種內(nèi)生固氮菌的植株葉內(nèi)酶活性明顯高于未接菌植株，提高了多枝檉柳(Tamarix ramosissima)植株在水鹽脅迫條件下的適應(yīng)能力和根系活力。因此，內(nèi)生細(xì)菌可以有效改善植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用效率，并可以通過影響植物的生理生化特性來增加植物的抗脅迫能力。

紫花針茅(Stipa capillata)是高寒草甸類草地的優(yōu)勢(shì)牧草之一，為多年生旱生草本植物，分布于我國(guó)華北、西北、青藏高原等地，特別是高寒草地的主要建群種[6]，其可以在高寒草地低溫和強(qiáng)紫外線等逆境條件下生存，這種抗逆能力是否與其內(nèi)生細(xì)菌有關(guān)?內(nèi)生細(xì)菌265ZY4菌株分離自東祁連山紫花針茅葉片，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，在離體條件下具有溶解無機(jī)磷和產(chǎn)吲哚乙酸(indole acetic acid，IAA)能力，且對(duì)多種植物病原真菌有較好的拮抗效果[7]，但這些生物功能對(duì)宿主紫花針茅的抗逆能力有怎樣的影響并不明確。因此，本研究建立不帶內(nèi)生細(xì)菌的紫花針茅種群，并回接265ZY4菌株，選擇與高寒草地生境相似的低溫(4℃)和紫外線等脅迫，測(cè)定葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖的含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-iyase，PAL)的活性，以期明確內(nèi)生細(xì)菌265ZY4對(duì)逆境脅迫下紫花針茅生化特征的影響，為揭示內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)功能及機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試內(nèi)生細(xì)菌:內(nèi)生枯草芽孢桿菌265ZY4由本課題組分離自高寒草地優(yōu)勢(shì)牧草紫花針茅葉片，保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原細(xì)菌及細(xì)菌多樣性實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 不帶內(nèi)生細(xì)菌紫花針茅種群培育和脅迫方法 2016年6月挑選籽粒飽滿、均一的紫花針茅種子，用0.1%升汞處理10 min，后用20%次氯酸鈉處理30 min，再溫湯浸種30 min，后置于水瓊脂培養(yǎng)基上催芽，選取萌芽一致并不帶菌的種子，播種于裝有營(yíng)養(yǎng)一致的無菌營(yíng)養(yǎng)土的50孔塑料育苗盤內(nèi)，置于控溫光照智能培養(yǎng)箱內(nèi)，光照強(qiáng)度為5000 lx，周期為12 h/12 h(晝/夜)，根據(jù)土壤濕度澆水，除高、低溫脅迫時(shí)間外均為25℃，待幼苗株高10 cm左右時(shí)，每孔灌根接種108cfu·g-1的內(nèi)生細(xì)菌菌液(將內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液5000 r·min-1離心10 min后收集菌體并用無菌水配制)2 m L，以接等量清水為對(duì)照;15 d后對(duì)紫花針茅進(jìn)行低溫(4℃)、高溫(40℃)和紫外線脅迫，每天4 h，在10:00-14:00進(jìn)行;3次重復(fù);紫外線脅迫為將幼苗置于紫外光光照智能培養(yǎng)箱內(nèi)，紫外燈燈管距離幼苗50 cm，于254 nm紫外光下4 h，其他時(shí)間正常管理;對(duì)照為不接種內(nèi)生細(xì)菌，其他同處理。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 接菌處理后25 d隨機(jī)選擇30株紫花針茅測(cè)定株高和葉寬并計(jì)算平均值。

于第0、2、4、6和8天下午脅迫后1 h(下午3點(diǎn))分別采集15株紫花針茅地上部分為樣品進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，3次重復(fù)。葉綠素含量采用SPAD-502葉綠素測(cè)定儀測(cè)定;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定[8];可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[9];超氧化物歧化酶活性采用四唑氮藍(lán)NBT光化還原法測(cè)定[9];苯丙氨酸解氨酶活性參照高峻鳳[10]的方法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，作圖時(shí)以對(duì)照為縱坐標(biāo)0，相對(duì)對(duì)照增加在橫坐標(biāo)軸上方區(qū)域，降低在橫坐標(biāo)軸下方區(qū)域;采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)紫花針茅株高和葉寬的影響

帶菌紫花針茅株高和葉寬分別為14.15和1.32 cm，較對(duì)照分別增加35.02%和34.69%(表1)，說明內(nèi)生細(xì)菌265ZY4對(duì)紫花針茅具有明顯的促生作用。

表1 內(nèi)生細(xì)菌265ZY4對(duì)紫花針茅株高和葉寬的影響Table 1 Effects of endophytic bacterium 265ZY4 on plant height and leaf width of S.purpurea(cm)

2.2 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)紫花針茅葉綠素含量的影響

在低溫脅迫下第2和4天時(shí)帶菌紫花針茅葉綠素含量比處理前分別增加了7.4%和1.5%，而對(duì)照第2和4天比脅迫前分別下降了4%和11%，但第8天時(shí)帶菌與對(duì)照均下降了43.7%和44.8%，差異不顯著(圖1A);在高溫脅迫下第2、4和6天時(shí)帶菌紫花針茅葉綠素含量比處理前分別增加了36.6%、11.1%和10.2%，而對(duì)照第2、4和6天時(shí)分別比脅迫前下降了5.6%、11.3%和38.1%，但第8天時(shí)帶菌與對(duì)照分別下降17.0%和44.0%，處理和對(duì)照差異顯著(P＜0.05)(圖1B);在紫外線脅迫下，帶菌和對(duì)照均下降，第2天時(shí)分別下降10.0%和24.0%，差異顯著(P＜0.05)，之后帶菌處理與對(duì)照差異不顯著(圖1C)。該結(jié)果表明紫花針茅在脅迫期間葉綠量含量均下降，但除紫外線脅迫外帶菌紫花針茅葉綠素含量脅迫前期增長(zhǎng)，后期下降，但下降率低于對(duì)照。

圖1 在低溫(A)、高溫(B)和紫外線(C)脅迫下紫花針茅葉綠素含量的變化率Fig.1 Change ratio of chlorophyll contents of S.purpurea after low temperature(A),high temperature(B)and ultraviolet stress(C)

2.3 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)紫花針茅可溶性蛋白的影響

紫花針茅可溶性蛋白受低溫、高溫和紫外光脅迫后均上升，除帶菌紫外線脅迫外均在第6天達(dá)到最高，之后迅速下降;第2天時(shí)帶菌與對(duì)照變化率差異顯著(P＜0.05)，但之后除紫外線脅迫第6天變化率差異變小外，第8天時(shí)基本一致(圖2)。

圖2 低溫(A)、高溫(B)和紫外線(C)脅迫下紫花針茅可溶性蛋白的變化率Fig.2 Change ratio of soluble protein contents of S.purpurea after low temperature(A),high temperature(B)and ultraviolet stress(C)

2.4 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)紫花針茅可溶性糖的影響

在低溫脅迫下帶菌紫花針茅可溶性糖呈先上升后下降趨勢(shì)，第4天達(dá)最大值，為5.20μg·g-1FW，對(duì)照呈下降趨勢(shì)，第2天為最大值，為4.81μg·g-1FW，對(duì)照和帶菌間差異顯著(P＜0.05);高溫脅迫下處理和對(duì)照均為第2天達(dá)最大值，分別為9.38和10.65μg·g-1FW，之后下降，第2、4和6天差異顯著(P＜0.05);在紫外線脅迫下，對(duì)照可溶性糖呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，第6天時(shí)最高，為5.10μg·g-1FW，比處理前上升了46.2%，第8天時(shí)明顯下降，僅比處理前增長(zhǎng)3.0%;帶菌紫花針茅可溶性糖在第2天時(shí)下降了7.3%，之后上升，第6天時(shí)達(dá)到最大值6.21μg·g-1FW，比處理前增加了74.9%，第8天時(shí)開始下降，但比處理前增加33.5%(圖3)。

圖3 低溫(A)、高溫(B)和紫外線(C)脅迫下紫花針茅可溶性糖的變化率Fig.3 Change ratio of soluble sugar contents of S.purpurea after low temperature(A),high temperature(B)and ultraviolet stress(C)

對(duì)照在低溫、高溫和紫外線脅迫下第2天均顯著高于帶菌處理(P＜0.05)，之后除紫外線脅迫外均下降;帶菌紫花針茅在低溫和紫外線脅迫下第2天后繼續(xù)上升，分別在第4和6天達(dá)到最大值。該結(jié)果說明紫花針茅內(nèi)生細(xì)菌265ZY4在第2天后對(duì)宿主紫花針茅可溶性糖有促進(jìn)作用。

2.5 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)紫花針茅超氧化物歧化酶(SOD)的影響

在低溫和高溫脅迫下，帶菌紫花針茅和對(duì)照超氧化物歧化酶活性均呈現(xiàn)為脅迫后快速下降，第2天后酶活性又上升，至第6天達(dá)到最高，分別為298.56和299.22 U·g-1FW，第8天下降到最小值;在低溫脅迫下除第6天外，帶菌紫花針茅變化率顯著小于對(duì)照(P＜0.05);高溫脅迫下除第8天外，帶菌紫花針茅和對(duì)照變化率差異不顯著，但第6天酶活性高于處理前，且?guī)Ь匣ㄡ樏└哂趯?duì)照;在紫外線脅迫下，帶菌紫花針茅呈先下降后上升趨勢(shì)，第8天時(shí)酶活性最高，為302.5 U·g-1FW，而對(duì)照第6天后開始下降，且?guī)Ь匣ㄡ樏㏒OD活性變化率除第8天外均顯著低于對(duì)照(P＜0.05)(圖4)?？傮w看，對(duì)照和帶菌紫花針茅(除帶菌紫外線脅迫外)均為第6天變化率位于相對(duì)較高位置，且?guī)Ь匣ㄡ樏┳兓市∮趯?duì)照;但是，帶菌紫花針茅在紫外線脅迫下呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且第6天酶活性低于脅迫前，第8天達(dá)最大值，而對(duì)照第2天低于脅迫前，第6天達(dá)到最大值，之后下降。

圖4 低溫(A)、高溫(B)和紫外線(C)脅迫下紫花針茅SOD活性的變化率Fig.4 Change ratio of SOD activity of S.purpurea after low temperature(A),high temperature(B)and ultraviolet stress(C)

2.6 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)紫花針茅苯丙氨酸解氨酶(PAL)的影響

在低溫、高溫和紫外線脅迫下，帶菌紫花針茅和對(duì)照苯丙氨酸解氨酶活性變化率均呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖5);帶菌紫花針茅和對(duì)照受低溫脅迫后PAL活性升高，第4天時(shí)PAL活性分別達(dá)到最高值368.9和302.4 U·g-1·min-1，脅迫第8天時(shí)帶菌紫花針茅和對(duì)照PAL活性均下降，但對(duì)照下降率高于帶菌植株(圖5A);紫花針茅PAL活性受高溫和紫外線脅迫后呈先降低后升高，再下降的趨勢(shì)，高溫脅迫第6天時(shí)PAL活性達(dá)到最高，對(duì)照和處理分別為295.3和290.2 U·g-1·min-1，而紫外線脅迫下對(duì)照第4天達(dá)到最大值，為277.1 U·g-1·min-1，處理第6天達(dá)到最大值，為294.1 U·g-1·min-1，第8天最低(圖5C)。

圖5 低溫(A)、高溫(B)和紫外線(C)脅迫下紫花針茅PAL活性的變化率Fig.5 Change ratio of PAL activity of S.purpurea after low temperature(A),high temperature(B)and ultraviolet stress(C)

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)生細(xì)菌通過其固氮、抑菌及產(chǎn)生生物活性物質(zhì)等生物功能，增強(qiáng)宿主植物的抗病性、抗蟲性、抗旱性和提高生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力等[11]。本研究中，紫花針茅接種內(nèi)生枯草芽孢桿菌265ZY4后株高和葉寬比對(duì)照分別增加35.02%和34.69%，這可能與該菌株在離體條件下具有溶磷、產(chǎn)IAA和抑菌等生物學(xué)功能[7]有關(guān);該結(jié)果也與Narendra等[12]報(bào)道的番茄(Lycopersicon esculentum)內(nèi)生細(xì)菌研究結(jié)果相一致。在低溫脅迫下，植物葉片的葉綠素降解是一個(gè)普遍現(xiàn)象[13]，而干旱抑制葉綠素生物合成酶的活性從而阻礙葉綠素的合成[14]，紫外線破壞植物葉綠體前體的形成和葉綠體整體結(jié)構(gòu)，降低葉綠素含量[15];本試驗(yàn)結(jié)果表明，在低溫和高溫脅迫下帶菌紫花針茅葉綠素含量先上升后下降，而對(duì)照呈持續(xù)下降趨勢(shì)，紫外線脅迫下帶菌和對(duì)照均呈下降趨勢(shì)，但接種內(nèi)生細(xì)菌的紫花針茅葉綠素含量高于對(duì)照，下降率低于對(duì)照，表明高、低溫和紫外線脅迫對(duì)紫花針茅葉綠素含量有明顯的破壞作用，但內(nèi)生細(xì)菌可能通過代謝產(chǎn)物保護(hù)宿主葉綠素或促進(jìn)了宿主葉綠素的合成，進(jìn)而使帶菌植株葉綠素含量高于對(duì)照，提高了抗逆能力，具體是何機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

可溶性蛋白和可溶性糖作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抗逆性中起到調(diào)節(jié)作用[16]。本試驗(yàn)中，可溶性蛋白和可溶性糖隨著脅迫時(shí)間呈先上升再下降的趨勢(shì)，與孫富等[17]和楊盛等[18]的報(bào)道一致，但楊玉珍等[19]報(bào)道，低溫脅迫下香椿(Toona sinensis)可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)“升高-降低-再升高”趨勢(shì)，本試驗(yàn)中可能在于脅迫時(shí)間不夠長(zhǎng)未能觀察到蛋白含量上升的趨勢(shì);在溫度脅迫下帶菌紫花針茅可溶性糖含量在第4天后顯著高于對(duì)照，特別是在紫外線脅迫下第6天后顯著高于對(duì)照，說明內(nèi)生細(xì)菌處理提高了宿主體內(nèi)的可溶性糖含量，但在逆境脅迫下可溶性蛋白含量與對(duì)照差異不明顯，說明內(nèi)生細(xì)菌在溫度脅迫中期和紫外線脅迫后期保持了可溶性糖的含量，提高了細(xì)胞的滲透壓，從而緩解逆境條件對(duì)植物的傷害，起到增強(qiáng)紫花針茅抗逆性的作用。低溫下可溶性糖較高溫下穩(wěn)定，且紫外線脅迫下最高峰出現(xiàn)較晚，這可能與宿主本身為高寒草地牧草，對(duì)低溫和紫外線脅迫本身有較高耐性有關(guān)，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

SOD等抗氧化酶可以清除逆境脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)積累的活性氧，減緩細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化[20]。本試驗(yàn)中，紫花針茅SOD活性隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，呈降低-升高-降低的規(guī)律，但波動(dòng)不大，表明溫度和紫外線脅迫對(duì)紫花針茅SOD活性的影響小;接種內(nèi)生細(xì)菌265ZY4的紫花針茅在溫度脅迫下SOD活性始終高于對(duì)照，但紫外光脅迫下SOD活性初期下降明顯，顯著低于對(duì)照，后上升，第8天時(shí)顯著高于對(duì)照，表明內(nèi)生細(xì)菌可以提高宿主SOD活性，提高其抗逆能力。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是類黃酮合成代謝與苯丙烷類代謝途徑過程中的限速酶和關(guān)鍵酶，類黃酮在減輕和消除由干旱、紫外線等脅迫引起的活性氧傷害方面，發(fā)揮直接或間接的作用[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明紫花針茅PAL活性隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升再下降的趨勢(shì)，這與陳雷等[22]研究結(jié)果一致，但在高溫和紫外線脅迫下呈下降-上升-下降的規(guī)律，低溫脅迫第4天達(dá)最大值，高溫和紫外線脅迫第6天時(shí)PAL活性達(dá)到最高;在低溫和紫外線脅迫下接種內(nèi)生細(xì)菌的紫花針茅PAL活性高于對(duì)照，且在低溫脅迫后期PAL活性下降的速度比對(duì)照減小1.3倍;該結(jié)果表明內(nèi)生細(xì)菌可有效地保持或提高PAL活性，增加次生化合物類黃酮等的合成，增強(qiáng)宿主對(duì)逆境脅迫的忍耐力。

從各種生化指標(biāo)看，第2天時(shí)除可溶性蛋白質(zhì)在高溫脅迫、SOD在低溫脅迫及PAL在紫外線脅迫外，對(duì)照與處理一致或高于處理，第2天之后帶菌紫花針茅生化指標(biāo)上升，第8天時(shí)帶菌處理變化率除SOD紫外線脅迫外均大幅下降，且葉綠素和可溶性蛋白變化率與對(duì)照基本一致。該結(jié)果說明帶菌紫花針茅生化指標(biāo)對(duì)外界環(huán)境的變化反應(yīng)滯后，且隨脅迫時(shí)間增長(zhǎng)生化指標(biāo)上升，但較長(zhǎng)時(shí)間脅迫后與對(duì)照沒有區(qū)別，即內(nèi)生細(xì)菌通過自身基因或影響植物體內(nèi)酶活性[23]可以提高宿主的抗逆能力，但這種保護(hù)作用有一定限度。