滕珂，張蕊，檀鵬輝，岳躍森，范希峰，武菊英*

(1.北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京100097;2.北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，北京100083)

植物為適應(yīng)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中遭受到的多種生物脅迫及非生物脅迫，進(jìn)化出了復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制[1]。轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)能夠結(jié)合啟動(dòng)子作用元件的DNA結(jié)合蛋白，通過(guò)激活或抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮功能[2]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族以APETALA2(AP2)結(jié)構(gòu)域來(lái)命名，是植物中最大的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與DNA結(jié)合。根據(jù)所含AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可以分為AP2、RAV和ERF(ethylene responsive factor，乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白)等類(lèi)型[3]。AP2轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，主要在花的發(fā)育和形態(tài)建成過(guò)程中起作用。RAV轉(zhuǎn)錄因子包含一個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域和一個(gè)B3結(jié)構(gòu)域，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫應(yīng)答[4]。ERF轉(zhuǎn)錄因子只含有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其結(jié)合的位點(diǎn)可分為兩類(lèi):一類(lèi)通過(guò)結(jié)合靶基因的GCC-box來(lái)對(duì)其轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，參與乙烯(ET)、茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)等激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;另一類(lèi)通過(guò)結(jié)合CCGAC位點(diǎn)參與多種非生物脅迫途徑[5-6]。

目前，前人已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsis thaliana)[6]、水稻(Oryza sativa)[7]、柑橘(Citrus reticulata)[8]和菜心(Brassica campestris)[9]等多種植物中克隆并鑒定出了ERF轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其功能展開(kāi)了深入研究。擬南芥AtERF 7結(jié)合GCC-box抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，減弱了保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)ABA的敏感性，提高了植物細(xì)胞的保水能力[10]。水稻OsERF 922可通過(guò)調(diào)控ABA合成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)源ABA的含量，從而改變水稻對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)能力[11]。柑橘Cit ERF 13通過(guò)結(jié)合Cit PPH啟動(dòng)子的DRE(dehydration-responsive element，干旱響應(yīng)元件)來(lái)調(diào)控其表達(dá)，促進(jìn)葉綠素降解[8]。進(jìn)一步研究揭示了Cit ERF13可通過(guò)抑制葉綠素合成、CO2羧化作用等多種途徑抑制光合效率[12]。菜心Br ERF72是一種可受MeJA(methyl jasmonate，茉莉酸甲酯)誘導(dǎo)，細(xì)胞核定位且具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)直接結(jié)合Br LOX4、Br AOC3和Br OPR3啟動(dòng)子的GCC或DRE/CRT(C-repeat，C重復(fù)元件)來(lái)參與JA合成途徑，進(jìn)而調(diào)控植物葉片衰老[9]。

結(jié)縷草(Zoysia japonica)是一種重要的暖季型草坪草，因其耐踐踏、抗旱性強(qiáng)、耐鹽等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪的建植及城市綠化[13-14]。然而，目前結(jié)縷草的遺傳資源研究仍十分有限，在GenBank中僅有500多條EST(expressed sequence tags，表達(dá)序列標(biāo)簽)序列[15]。深入挖掘結(jié)縷草優(yōu)良的基因資源，不僅可以增強(qiáng)對(duì)結(jié)縷草抗逆分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)，而且有助于結(jié)縷草性狀改良育種。雖然已經(jīng)從一些模式植物中克隆得到ERF基因，但是ERF在結(jié)縷草中的功能研究還鮮有報(bào)道，其功能并不清楚。本研究利用RACE(rapid amplification of cDNA ends，c DNA末端快速克隆)技術(shù)首次從日本結(jié)縷草中克隆得到Zj ERF 1基因，同時(shí)利用染色體步移方法對(duì)其啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆，并對(duì)ZjERF 1基因與其啟動(dòng)子進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;研究了ZjERF1的轉(zhuǎn)錄激活活性和亞細(xì)胞定位特征，并分析了激素及鹽、干旱脅迫處理后ZjERF 1基因的表達(dá)情況，旨在為深入研究Zj ERF 1基因的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的日本結(jié)縷草品種‘Meyer’由江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所劉建秀研究員惠贈(zèng)，種植于溫室，農(nóng)桿菌EHA105、亞細(xì)胞定位載體3302Y3、酵母雙雜交載體pGBKT7、Y2HGold酵母菌株及本生煙草(Nicotiana benthamiana)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。RACE試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BglⅡ快切酶、Bam HⅠ快切酶、p MD-19T、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、Infusion連接酶和酵母缺陷型培養(yǎng)基等購(gòu)于寶生物公司(Ta KaRa)。RNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)于天根生化科技公司。PCR Mix、SYBR Mix購(gòu)自康為世紀(jì)公司。PEG4000、乙烯(ET)、脫落酸(ABA)和茉莉酸甲脂(MeJA)購(gòu)于SIGMAALDRICH。

1.2 方法

1.2.1 Zj ERF 1克隆與生物信息學(xué)分析 利用試劑盒提取健康生長(zhǎng)的日本結(jié)縷草葉片RNA。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)5′/3′RACE的引物(表1)，按照RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行5′/3′RACE。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物純化后連接克隆載體p MD-19T，檢測(cè)為陽(yáng)性的菌液送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，利用DNAMAN 8.0拼接測(cè)序結(jié)果。根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)引物ZjERF1-F/R，以日本結(jié)縷草cDNA為模板擴(kuò)增基因全長(zhǎng)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃10 min;95℃30 s，57℃30 s，72℃45 s，30個(gè)循環(huán);72℃5 min，12℃保溫。目的片段純化后連接克隆載體，檢測(cè)后測(cè)序，測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

利用DNAMAN 8.0軟件預(yù)測(cè)基因編碼的氨基酸序列。保守結(jié)構(gòu)域分析及同源比對(duì)利用NCBI的Blast功能，用CLUSTALW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)和BoxShade(https://embnet.vital-it.ch/software/BOX_form.html)在線軟件作圖。蛋白質(zhì)的親疏水性、分子量及等電點(diǎn)推導(dǎo)用ProtParam。信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用SignalP 4.1。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建。亞細(xì)胞定位情況預(yù)測(cè)用Softberry網(wǎng)站。

表1 引物列表Table 1 Primer list of this study

1.2.2 ZjERF 1啟動(dòng)子克隆與作用元件預(yù)測(cè)分析 CTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide，溴化十六烷基三甲銨)法提取健康生長(zhǎng)的日本結(jié)縷草葉片DNA，根據(jù)ZjERF 1基因gDNA序列的5′端設(shè)計(jì)染色體步移的3條特異性引物SP1、SP2、SP3(表1)，以日本結(jié)縷草基因組DNA為模板進(jìn)行染色體步移，反應(yīng)結(jié)束后將2、3輪產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶單一的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序。根據(jù)染色體步移測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物ZjERF1-Pro-F/R(表1)擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，反應(yīng)程序?yàn)?5℃10 min;95℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán);72℃5 min，12℃保溫，PCR產(chǎn)物純化后連接p MD-19T載體，陽(yáng)性菌液送測(cè)序。通過(guò)PLACE網(wǎng)站(https://sogo.dna.affrc.go.jp)預(yù)測(cè)Zj ERF 1基因啟動(dòng)子可能存在的作用元件。

1.2.3 ZjERF1轉(zhuǎn)錄激活活性驗(yàn)證 以測(cè)序正確的p MD-ZjERF1質(zhì)粒為模板，BD-ERF1-F/R為引物(表1)，用PrimeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?8℃10 s，98℃10 s，68℃30 s，25個(gè)循環(huán);72℃3 min，12℃保溫。利用Bam HⅠ單酶切p GBKT7載體，PCR儀中反應(yīng)15 min。將PCR產(chǎn)物及載體單酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，之后在In-Fusion連接酶的作用下進(jìn)行同源重組。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單克隆送公司測(cè)序，測(cè)序正確的菌液提質(zhì)粒，保菌備用。利用Li AC(lithium acetate，醋酸鋰)法[16]，將pGBKT7-ZjERF1轉(zhuǎn)化為酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于一缺培養(yǎng)基(SD-Trp)，30℃培養(yǎng)2 d左右。挑取單克隆，PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液，以p GBKT7空載體為對(duì)照，分別稀釋10、100倍上樣，利用Cannon EOS 60D拍照。

1.2.4 Zj ERF1亞細(xì)胞定位 設(shè)計(jì)亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建引物3302Y3-ERF1-F/R(表1)，以含有目的基因的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的條帶，用In-Fusion連接酶將PCR純化產(chǎn)物連接入BglⅡ單酶切過(guò)的3302Y3載體。構(gòu)建好的亞細(xì)胞定位載體35S::Zj ERF1:YFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。采用瞬時(shí)表達(dá)的方法，將成功轉(zhuǎn)化目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射本生煙草葉片，暗培養(yǎng)48 h[17]。以3302Y3空載體為對(duì)照，利用激光共聚焦顯微鏡(Leica SP-5)觀察YFP熒光在細(xì)胞中的分布情況。

1.2.5 ZjERF 1的表達(dá)分析 剪取正常生長(zhǎng)的日本結(jié)縷草成熟植株的根、莖、葉做組織差異分析;剪取幼嫩葉片、成熟葉片、衰老葉片，做不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析。選取5盆長(zhǎng)勢(shì)一致的日本結(jié)縷草分別噴施200μmol·L-1ET、10μmol·L-1ABA、10μmol·L-1MeJA，澆灌300 mmol·L-1NaCl和20%PEG4000。在處理第0、1、3、6、12、24 h分別剪取不同處理的葉片，液氮速凍后-80℃保存。提取上述樣品總RNA，經(jīng)NanoDrop ND-1000檢測(cè)合格后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)熒光定量引物qERF1-F/R(表1)，以日本結(jié)縷草Actin基因(GenBank登錄號(hào):GU290546)為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，4個(gè)技術(shù)重復(fù)。用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[18]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2010計(jì)算表達(dá)量，SPSS 18.0進(jìn)行方差分析，SigmaPlot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zj ERF 1全長(zhǎng)的獲得與生物信息學(xué)分析

通過(guò)RACE方法從日本結(jié)縷草中克隆得到目的基因，命名為Zj ERF 1(圖1)。該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?30 bp，編碼209個(gè)氨基酸(GenBank登錄號(hào):MH294481)。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因編碼的蛋白屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子家族。氨基酸序列同源比對(duì)結(jié)果顯示，ZjERF1與玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)及水稻同源性均在80%以上(圖2A)。一級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，該基因編碼蛋白分子量為22.48 k D;理論等電點(diǎn)為5.0，其中陰性氨基酸(Asp+Glu)29個(gè)，陽(yáng)性氨基酸(Arg+Lys)21個(gè);親水性平均系數(shù)為-0.285，屬于親水性蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ZjERF1不含信號(hào)肽;構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，ZjERF1與粳稻(Oryza sativa)AP2/ERF-like(BAD 19440.1)親緣關(guān)系最近(圖2B)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ZjERF1定位于細(xì)胞核。

2.2 Zj ERF 1啟動(dòng)子的克隆與作用原件分析

染色體步移結(jié)束后，將2、3輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖3A)，條帶清晰的PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，最終獲得Zj ERF 1基因ATG上游1581 bp序列。根據(jù)得到的序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Zj ERF 1啟動(dòng)子，得到目的條帶與預(yù)期相符，經(jīng)測(cè)序分析確定為Zj ERF 1啟動(dòng)子序列。PLACE啟動(dòng)子在線預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，Zj ERF 1啟動(dòng)子序列中除了有CAAT-box、TATA-box等基本順式作用元件，還含有與光、植物激素等相關(guān)的順式調(diào)控元件。該序列上有1個(gè)脫落酸響應(yīng)元件(ABRE:ABA-responsive element，茉莉酸響應(yīng)元件)，8個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(4個(gè)CGTCA-motif，4個(gè)TGACG-motif)和1個(gè)水楊酸響應(yīng)元件。此外，還有HSE(heat shock element，熱休克元件)、MBS(MYB binding site，MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn) )、LTR(low-temperature responsiveness，低溫響應(yīng)元件)和TC-rich repeat等若干與非生物脅迫關(guān)的應(yīng)答元件(圖3B)。

圖1 Zj ERF 1基因的克隆Fig.1 Cloning of Zj ERF 1 gene

圖2 Zj ERF 1同源性比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Sequences alignment and phylogenetic analysis of Zj ERF1

圖3 啟動(dòng)子克隆的染色體步移及其作用元件分析Fig.3 Genome walking for isolating promoter and cis-elements analysis

2.3 ZjERF1轉(zhuǎn)錄激活活性分析

盡管大量研究發(fā)現(xiàn)AP2/ERF家族的轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制的作用，而ZjERF1的轉(zhuǎn)錄活性特征并不清楚。為分析ZjERF1是否具有激活活性，將構(gòu)建成功的p GBKT7-ZjERF1載體轉(zhuǎn)化Y2 HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞，以p GBKT7空載體為對(duì)照。結(jié)果顯示，在SD-Trp培養(yǎng)基上對(duì)照和p GBKT7-Zj ERF1均可正常生長(zhǎng)。之后，將成功轉(zhuǎn)化目的質(zhì)粒的菌液分別稀釋1、10和100倍后點(diǎn)樣在SD-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上觀察其生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，對(duì)照不能在SD-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而p GBKT7-ZjERF1可正常生長(zhǎng)。本試驗(yàn)表明:ZjERF1具有較強(qiáng)的自激活活性(圖4)。

圖4 Zj ERF1轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證Fig.4 Auto-transcriptional activation assay

2.4 ZjERF1亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Zj ERF1定位于細(xì)胞核，為了進(jìn)一步研究ZjERF1的定位情況，構(gòu)建35S::ZjERF1:YFP載體，以空載35S::YFP為對(duì)照，質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后注射本生煙草葉片，48 h暗培養(yǎng)后在Leica SP-5激光共聚焦顯微鏡下觀察黃色熒光蛋白分布(yellow fluorescence protein，YFP)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)35S::YFP的熒光信號(hào)分布于整個(gè)細(xì)胞中，而ZjERF1定位于細(xì)胞核(圖5)。

圖5 ZjERF1的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of ZjERF1

2.5 Zj ERF 1表達(dá)模式分析

熒光定量結(jié)果顯示，Zj ERF 1在根、莖、葉中均有表達(dá)，但在莖中的表達(dá)量顯著高于根和葉片，分別是根中的2.37倍，葉片中的1.77倍(圖6A);Zj ERF 1在不同發(fā)育時(shí)期的葉片中表達(dá)量也明顯不同，與衰老程度呈正相關(guān)性，其在衰老葉片中的表達(dá)量最高，幼嫩葉片中的表達(dá)量最低。其中衰老葉片的表達(dá)量分別是成熟葉片的1.41倍，幼嫩葉片的2.59倍(圖6B)。

ET、ABA及MeJA激素處理后的熒光定量結(jié)果表明:ZjERF 1的表達(dá)可以受到ET的誘導(dǎo)，在處理的第6 h達(dá)到最高水平，為初始水平的5.12倍(圖6C);Zj ERF 1的表達(dá)在噴施ABA后的前3 h呈下降趨勢(shì)，但在處理的第6 h表達(dá)量顯著升高，為第3 h的20.0倍，之后又表現(xiàn)出顯著下降的趨勢(shì)(圖6D);Zj ERF 1的表達(dá)總體上受到MeJA的誘導(dǎo)，在處理6 h達(dá)到峰值，為初始水平的2.31倍(圖6E)。

高鹽和干旱脅迫處理后的熒光定量數(shù)據(jù)顯示:在處理的24 h內(nèi)，300 mmol·L-1的NaCl處理誘導(dǎo)了Zj ERF 1的表達(dá)，具體表現(xiàn)為在第3 h開(kāi)始升高，為第1 h的1.39倍，而在第12 h達(dá)到峰值，為處理前的3.99倍(圖6F)。而20%的PEG4000處理顯著抑制Zj ERF 1的表達(dá)，表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，在6 h達(dá)到最低值，為初始水平的1.47×10-3倍(圖6G)。

3 討論

目前關(guān)于ERF基因的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物中，在結(jié)縷草上的研究卻鮮有報(bào)道。本研究利用RACE的方法從日本結(jié)縷草中克隆得到ZjERF 1基因，蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明，ZjERF 1屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子家族。Zj ERF 1擁有1個(gè)高度保守的含有65個(gè)氨基酸殘基的AP2 DNA結(jié)構(gòu)域，具有高度結(jié)合GCC-box的潛力，能夠調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[6]。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)ZjERF1與粳稻AP2/ERF-like(BAD19440.1)的親緣關(guān)系最近。擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)，EAR motif對(duì)于ERF轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的作用至關(guān)重要[19]。本研究轉(zhuǎn)錄激活活性分析表明，ZjERF1具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性，可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，分析這可能與其不含EAR-motif有關(guān)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，ZjERF1定位于細(xì)胞核，這與柑橘CitERF13[20]、小麥(Triticum aestivum)TaERF W17[21]、菜心Br ERF72[9]的定位結(jié)果一致。以上結(jié)果表明:ZjERF1屬于典型的ERF轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄激活活性，定位于細(xì)胞核，可調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)，能夠參與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。

圖6 Zj ERF 1表達(dá)特征分析Fig.6 Real-time quantitative PCR of Zj ERF1 expression characters

啟動(dòng)子作為基因的組成部分，控制轉(zhuǎn)錄起始的過(guò)程，它在一定程度上決定了基因表達(dá)的時(shí)間、部位及強(qiáng)度，啟動(dòng)子的研究是基因表達(dá)調(diào)控研究的基礎(chǔ)[22]。作用元件是RNA聚合酶直接結(jié)合的區(qū)域，對(duì)啟動(dòng)子的活性影響顯著[23]。前人研究表明，不同植物中的ERF轉(zhuǎn)錄因子可同時(shí)響應(yīng)茉莉酸、脫落酸、非生物脅迫等因素的調(diào)節(jié)[9，24]。本研究通過(guò)染色體步移的方法獲得了Zj ERF 1基因ATG上游1581 bp序列，分析發(fā)現(xiàn)，該序列上除了含有TA-TA-box、CAAT-box等基本作用元件以外，還存在著多個(gè)響應(yīng)MeJA、ABA和非生物脅迫誘導(dǎo)(干旱、熱、冷)的作用元件。據(jù)此推斷Zj ERF 1是一個(gè)非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，可同時(shí)參與激素信號(hào)傳導(dǎo)和響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程，并在其中行使著不同的功能，值得深入開(kāi)展研究。此外，啟動(dòng)子作用元件分析預(yù)測(cè)Zj ERF 1可受MeJA等激素和非生物脅迫的調(diào)節(jié)，為進(jìn)一步研究ZjERF 1的表達(dá)特征提供了依據(jù)。

不同組織熒光定量結(jié)果顯示，Zj ERF 1在根、莖、葉中均有表達(dá)，其中莖中的表達(dá)量顯著高于其在根和葉片中的表達(dá)量，這與擬南芥AtRAP 2.6的表達(dá)特征一致[24]。不同發(fā)育時(shí)期的葉片熒光定量結(jié)果表明，Zj ERF 1在衰老葉片中的表達(dá)量最高，這與菜心BrERF 72的研究結(jié)果一致[9]。植物葉片的衰老與乙烯的合成密切相關(guān)，而ERF作為乙烯途徑中的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在葉片衰老過(guò)程中發(fā)揮著重要功能[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)噴施ET可誘導(dǎo)Zj ERF 1的表達(dá)，這與ORA 59的表達(dá)情況一致[27]。這表明Zj ERF 1可響應(yīng)乙烯信號(hào)，推測(cè)可以在乙烯調(diào)控的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。研究表明ABA是一種促衰老激素，外源ABA可以誘導(dǎo)衰老相關(guān)的基因的表達(dá)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)ABA可調(diào)控Zj ERF 1基因的表達(dá)，這與擬南芥AtRAP 2.6[24]和檉柳(Tamarix hispida)Th ERF 7[29]的表達(dá)情況一致，說(shuō)明Zj ERF 1可參與ABA調(diào)節(jié)的葉片衰老過(guò)程。菜心中的研究結(jié)果表明，BrERF 72可受JA的誘導(dǎo)，并通過(guò)直接結(jié)合JA合成基因的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)JA的合成，證明了ERF可參與JA調(diào)節(jié)的葉片衰老[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)Zj ERF 1啟動(dòng)子含有多個(gè)響應(yīng)MeJA的作用元件，并且MeJA處理顯著誘導(dǎo)ZjERF 1的表達(dá)，因此Zj ERF 1可能參與了調(diào)控植物衰老的進(jìn)程，需要進(jìn)一步的研究挖掘下游靶基因。此外，我們還發(fā)現(xiàn)Zj ERF 1的表達(dá)在NaCl處理的第12 h急劇升高，這與Th ERF 7的表達(dá)情況類(lèi)似;而Zj ERF 1的表達(dá)在PEG處理的24 h內(nèi)始終表現(xiàn)出受抑制的趨勢(shì)，與Th ERF 6的情況一致[29]。以上分析說(shuō)明Zj ERF 1的表達(dá)可受多種條件的調(diào)控，推測(cè)其在激素信號(hào)傳導(dǎo)和非生物脅迫中發(fā)揮著不同的作用。

4 結(jié)論

日本結(jié)縷草Zj ERF 1基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?30 bp，編碼209個(gè)氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，Zj ERF 1屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子家族。同時(shí)，通過(guò)染色體步移的方法得到Zj ERF 1基因ATG上游1581 bp的啟動(dòng)子序列，該序列含有多個(gè)響應(yīng)MeJA及非生物脅迫的作用元件。轉(zhuǎn)錄激活分析表明，Zj ERF1具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，ZjERF1定位于細(xì)胞核。熒光定量數(shù)據(jù)表明，Zj ERF 1在衰老葉片中的表達(dá)量最高，且Zj ERF 1的表達(dá)受ET、MeJA及鹽和干旱處理的調(diào)節(jié)。本研究表明Zj ERF 1可響應(yīng)多種因素的調(diào)節(jié)，并在激素信號(hào)傳導(dǎo)和非生物脅迫中發(fā)揮著不同的作用，為進(jìn)一步探索Zj ERF 1基因的功能及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。