李晨，謝曉東，王景太，崔春陽，王萬坤，陳小強(qiáng)

大麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)、繼代及分化研究

李晨，謝曉東，王景太，崔春陽，王萬坤，陳小強(qiáng)通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

以大麥品種G1614成熟胚為研究對(duì)象，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，探討2,4-D質(zhì)量濃度、碳源和成熟胚切割方式對(duì)大麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以及NAA/KT配比對(duì)大麥愈傷組織分化的影響。結(jié)果表明：2,4-D質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，大麥成熟胚出愈率較高；30 g/L蔗糖作為碳源時(shí)，大麥成熟胚愈傷誘導(dǎo)率較高；縱切大麥成熟胚會(huì)促進(jìn)大麥愈傷組織的誘導(dǎo)；在分化培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L NAA和4.0 mg/L KT時(shí)，可使大麥愈傷組織獲得較高的分化率。

大麥；成熟胚；愈傷組織；分化

大麥（L.）屬禾本科植物，為第四大谷類作物，其品種遺傳改良研究一直倍受重視[1]。目前，大麥主要作為啤酒生產(chǎn)的原料以及飼料作物使用。我國大麥的年需求量巨大且逐年增加，而國內(nèi)大麥由于產(chǎn)量和品質(zhì)等因素的制約難以滿足國內(nèi)市場的巨大需求，導(dǎo)致我國大麥嚴(yán)重依賴于進(jìn)口，這在一定程度上制約了大麥及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，如何提高大麥的品質(zhì)和產(chǎn)量成為我國大麥研究的重點(diǎn)。

組織培養(yǎng)在生物工程育種中扮演了十分重要的角色，是生物工程研究的基礎(chǔ)，是遺傳轉(zhuǎn)化、植物改良等研究的重要環(huán)節(jié)之一，在水稻、小麥等禾本科作物上均有廣泛應(yīng)用[2-8]。本研究以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以大麥品種G1614的成熟胚為研究對(duì)象，研究激素、碳源和切割方式對(duì)大麥成熟胚愈傷誘導(dǎo)、繼代及分化的影響，旨在優(yōu)化大麥遺傳再生體系，改良大麥產(chǎn)量與品質(zhì)，同時(shí)對(duì)大麥轉(zhuǎn)基因等方面研究也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大麥品種G1614種子成熟胚。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基基本組成

誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基1：MS＋30 g/L蔗糖＋2,4-D＋7 g/L瓊脂（pH＝5.8～6.0），2,4-D質(zhì)量濃度分別為3、4、5 mg/L。

誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基2：MS＋碳源＋6 mg/L 2,4-D＋7 g/L瓊脂（pH＝5.8～6.0），在縱切條件下，不同碳源濃度分別為30 g/L蔗糖、20 g/L蔗糖＋10 g/L麥芽糖或30 g/L麥芽糖。

分化培養(yǎng)基：MS＋30 g/L 蔗糖＋NAA/KT＋7 g/L瓊脂（pH＝5.8～6.0），NAA/KT濃度分別為0.3/3.0、0.3/4.0、0.3/5.0、0.4/3.0、0.4/4.0、0.4/5.0、0.5/3.0、0.5/4.0、0.5/5.0 mg/L。

1.2.2 大麥種子預(yù)處理

試驗(yàn)接種前，將保存于4 ℃冰箱的大麥種子取出，25 ℃水中浸泡14～16 h，剝除泡好種子的穎殼，在超凈工作臺(tái)中用75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3～5次，5%次氯酸鈉處理15 min，再用無菌水沖洗3～5次。

1.2.3 大麥種胚的獲取與接種

在超凈工作臺(tái)中用無菌解剖針將消毒處理后大麥籽粒的胚挑出，進(jìn)行整胚、縱切、橫切3種處理，然后接種到培養(yǎng)瓶中，每瓶接種6個(gè)，每處理接種25瓶。在黑暗條件下培養(yǎng)15 d后，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 大麥成熟胚愈傷組織的繼代

接種15 d后，將G1614成熟胚所誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)基為1.2.1中愈傷誘導(dǎo)最優(yōu)培養(yǎng)基，每周繼代1次，共繼代3次。

1.2.5 大麥愈傷組織的分化

將連續(xù)繼代3次之后的愈傷組織進(jìn)行分化研究，選用KT和NAA為激素，分化培養(yǎng)基配方見1.2.1。每瓶接種5個(gè)愈傷組織，每處理接種20瓶，15 d后統(tǒng)計(jì)計(jì)算愈傷組織分化率。

1.3 培養(yǎng)條件

愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)：25 ℃，黑暗條件。愈傷組織分化培養(yǎng)：25 ℃，光照16 h/d。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

出愈率（%）＝大麥成熟胚出愈塊數(shù)/大麥種胚接種個(gè)數(shù)×100％

分化率（%）＝大麥分化愈傷塊數(shù)/大麥愈傷接種塊數(shù)×100％

數(shù)據(jù)采用SPSSAU數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2,4-D質(zhì)量濃度對(duì)G1614縱切成熟胚出愈率的影響

由表1可知，在添加30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，將大麥種子胚縱切，2,4-D質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，可獲得較高的出愈率，為78.33%。

表1 不同2,4-D質(zhì)量濃度下大麥成熟胚的出愈率

由表2可知，2,4-D質(zhì)量濃度和出愈率之間的相關(guān)系數(shù)值為1.000，并且呈0.01水平的顯著性，說明2,4-D質(zhì)量濃度和出愈率之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

表2 2,4-D質(zhì)量濃度與大麥出愈率Spearman相關(guān)性分析

注：**＜0.01

2.2 不同種類碳源對(duì)G1614縱切成熟胚出愈率的影響

由表1可知，2,4-D質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，有較好的出愈率，因此在分析碳源對(duì)大麥縱切胚出愈率的影響時(shí)，選擇含有5 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時(shí)添加不同碳源，將大麥種子胚縱切接種于培養(yǎng)基上，得到碳源對(duì)G1614縱切胚出愈率的影響。由表3可知，當(dāng)培養(yǎng)基中添加30 g/L蔗糖時(shí)，可使G1614縱切胚具有較高的出愈率。

表3 碳源對(duì)大麥縱切成熟胚出愈率的影響

由表4可知，碳源和出愈率之間的相關(guān)系數(shù)值為0.500，并且＞0.05，說明碳源和G1614縱切胚出愈率之間并沒有相關(guān)關(guān)系。

表4 碳源和大麥縱切成熟胚出愈率Spearman相關(guān)性分析

2.3 切割方式對(duì)G1614成熟胚出愈率的影響

由表1和表3可知，當(dāng)培養(yǎng)基中添加5 mg/L 2,4-D和30 g/L蔗糖時(shí)，有較好的出愈率，因此，在研究切割方式對(duì)G1614愈傷組織的影響時(shí)，選擇添加5 mg/L 2,4-D和30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。由表5可以看出，縱切G1614成熟胚可以得到較高的出愈率。

表5 切割方式對(duì)G1614出愈率的影響

由表6可知，切割方式和出愈率之間的相關(guān)系數(shù)值為0.500，并且＝0.05，說明切割方式和出愈率之間并沒有相關(guān)關(guān)系。

表6 切割方式和大麥縱切成熟胚出愈率Spearman相關(guān)性分析

2.4 G1614成熟胚的繼代培養(yǎng)

G1614成熟胚在接種3 d后開始長出愈傷組織（圖1），隨著誘導(dǎo)時(shí)間的逐漸增加，愈傷組織的大小、顏色等形態(tài)結(jié)構(gòu)都會(huì)發(fā)生變化，有的愈傷組織會(huì)直接發(fā)芽。如果培養(yǎng)基長時(shí)間不進(jìn)行替換，因培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的消耗等因素的影響，愈傷組織的生長會(huì)受到抑制甚至發(fā)生褐變，而影響愈傷質(zhì)量。因此本研究在愈傷誘導(dǎo)15 d之后對(duì)愈傷組織進(jìn)行繼代處理，繼代培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基＋10 g/L蔗糖＋20 g/L麥芽糖＋6.5 g/L瓊脂＋3.0 mg/L 2,4-D，每周繼代1次，共繼代3次。繼代之后疏松的愈傷組織發(fā)生明顯變化，淡黃色致密胚性愈傷組織數(shù)量逐漸增多（圖2）。

圖1 G1614初生愈傷組織

圖2 G1614 胚性愈傷組織

2.5 G1614愈傷組織分化研究

對(duì)G1614愈傷組織進(jìn)行分化研究，由表7可知，當(dāng)NAA/KT濃度為0.5/4.0 mg/L時(shí)，愈傷組織分化率可達(dá)較高水平。

表7 G1614愈傷組織分化率統(tǒng)計(jì)

由表8可知，NAA/KT配比和分化率之間的相關(guān)系數(shù)值為-0.050，說明NAA/KT配比和分化率間并沒有相關(guān)關(guān)系。

表8 NAA/KT配比和G1614愈傷組織分化率Spearman相關(guān)性分析

本研究結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基＋0.5 mg/L NAA＋4.0 mg/L KT＋0.25 g/L肌醇＋1 g/L脯氨酸＋1 g/L CH＋30 g/L蔗糖＋7 g/L瓊脂時(shí)，對(duì)G1614愈傷組織分化效果較為理想。

3 討論與結(jié)論

3.1 大麥成熟胚誘導(dǎo)及其影響因素

大麥成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響因素眾多，本試驗(yàn)選取了激素濃度、碳源、種胚處理方式對(duì)大麥成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響進(jìn)行研究。

大麥成熟胚出愈率研究結(jié)果表明，2,4-D誘導(dǎo)大麥成熟胚愈傷組織的最適濃度為4～5 mg/L，而任江萍等用2.0 mg/L 2,4-D對(duì)大麥種胚進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，獲得較高的誘導(dǎo)率[9]，這與本研究結(jié)果存在差異，可能是所選品種不同造成了2,4-D質(zhì)量濃度對(duì)大麥種胚出愈率的影響不同。林國梁等認(rèn)為添加2.0～5.0 mg/L 2,4-D有利于誘導(dǎo)成熟胚愈傷組織的形成[10]。

大麥成熟胚處理方式對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)也有明顯影響，雖然本研究中Spearman分析表明切割方式和出愈率之間并沒有相關(guān)關(guān)系。但研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)大麥成熟胚進(jìn)行整胚接種和橫切接種時(shí)，在愈傷組織誘導(dǎo)過程中，均有一部分種胚直接發(fā)芽，這嚴(yán)重影響了愈傷組織的出愈率。而將種胚進(jìn)行縱切處理，種胚的直接出芽情況明顯減少，同時(shí)愈傷組織的出愈率也顯著提高。陳升位等通過４種切割處理對(duì)成熟胚出愈率的影響進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)橫切部分胚芽、橫切部分胚芽-胚根以及縱切部分成熟胚均可提高多棱裸大麥成熟胚的出愈率，橫切部分胚根對(duì)出愈率沒有明顯的促進(jìn)作用[11]。此外，也有研究者將種胚進(jìn)行刮碎處理，以破壞種胚的完整性，同樣取得成功，并減少了種胚的發(fā)芽情況[12]。本研究表明在大麥成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，將種胚進(jìn)行縱切，愈傷誘導(dǎo)率較高，這與陸瑞菊等的試驗(yàn)結(jié)果相一致[13]。

不同種類碳源也會(huì)影響大麥成熟胚的出愈率。蔗糖是組織培養(yǎng)中最常用的碳源，在植物組織培養(yǎng)中，糖的用量不僅影響培養(yǎng)物的生長速度和生長量，還影響其代謝水平、次生代謝物的合成、以及細(xì)胞的形態(tài)和發(fā)生，是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素之一[14]。本研究表明，在碳源質(zhì)量相同時(shí)，使用蔗糖和麥芽糖（1∶2）比單純使用蔗糖做碳源時(shí)的愈傷組織出愈率略高，Spearman分析表明沒有顯著相關(guān)性，說明碳源的成分和濃度雖然也會(huì)對(duì)大麥成熟胚誘導(dǎo)愈傷產(chǎn)生一定的影響，但影響不大。有研究表明，由于培養(yǎng)基的滲透壓發(fā)生了變化從而對(duì)大麥成熟胚的出愈率產(chǎn)生了一定的影響。徐鳳在以節(jié)節(jié)麥幼胚為試驗(yàn)材料、碳源為誘導(dǎo)因素的研究中也表明，碳源種類對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)沒有顯著性影響[15]。呂芝香認(rèn)為葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖等碳源對(duì)培養(yǎng)組織生長速度雖有差異，但都是良好的碳源[16]。

3.2 愈傷繼代及NAA/KT濃度配比對(duì)大麥愈傷組織分化的影響

大麥成熟胚愈傷組織分化主要受基因型、激素配比、愈傷組織質(zhì)量等因素影響[17-18]。大麥成熟胚所誘導(dǎo)的愈傷組織形態(tài)和質(zhì)量各不相同?？傮w來說愈傷組織分為兩種，一種為疏松透明的非胚性愈傷組織，另一種為淡黃色致密的胚性愈傷組織。本研究選用較好基因型的大麥品種G1614作為試驗(yàn)材料，在愈傷誘導(dǎo)15 d后對(duì)愈傷組織進(jìn)行繼代處理，結(jié)果表明繼代促進(jìn)胚性愈傷組織的數(shù)量明顯增多。前人也有研究結(jié)果表明，非胚性愈傷組織可通過繼代轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤M織[19]，這有利于愈傷組織分化苗的形成。

在基因型一定的情況下，選擇合適的激素配比是提高愈傷組織分化率的最好方法[20]。有研究表明，6-BA和IAA不同濃度配比對(duì)節(jié)節(jié)麥成熟胚愈傷分化有較大影響[21]。任江萍等認(rèn)為，添加1.0 mg/L ZT和0.1 mg/L IAA，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化的效果比較理想[22]。愈傷組織分化培養(yǎng)時(shí)期，需降低或完全去掉生長素類物質(zhì)，才有利于分化苗的形成[23]。添加 l mg/L 6-BA、2,4-D 對(duì)抑制愈傷組織的分化有明顯效應(yīng)[22]。本研究中將NAA/KT兩種激素進(jìn)行組合試驗(yàn)，結(jié)果表明NAA/KT不同濃度配比對(duì)大麥愈傷組織分化率的影響明顯不同，從所選幾個(gè)濃度來看，0.5 mg/L NAA配比4.0 mg/L KT，對(duì)G1614成熟胚愈傷組織分化效果較好。

3.3 結(jié)論

本研究得到如下結(jié)論：

（1）在愈傷誘導(dǎo)過程中，不同2,4-D質(zhì)量濃度下大麥成熟胚愈傷誘導(dǎo)率存在差異，2,4-D質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，大麥成熟胚出愈率較高。

（2）在愈傷誘導(dǎo)過程中，切割方式對(duì)大麥成熟胚出愈率影響沒有顯著性差異，但縱切胚和整胚與橫切胚接種出愈率存在差異，縱切種胚的直接出芽情況明顯減少。因此，誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，將大麥成熟胚進(jìn)行縱切處理可獲得較高的出愈率。

（3）大麥品種G1614愈傷最適分化培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基＋0.5 mg/L NAA＋4.0 mg/L KT＋0.25 g/L肌醇＋1 g/L脯氨酸＋1 g/L CH＋30 g/L蔗糖＋7 g/L瓊脂。

[1] 胡有良，汪軍成，司二靜，等. 大麥莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)和植株高頻再生[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)，2017，37（5）：601-608.

[2] 王立艷，裴忠有，孫守鈞，等. 不同的激素配比及培養(yǎng)基類型對(duì)蘇丹草185愈傷組織誘導(dǎo)率的影響[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，13（4）：25-27.

[3] 裴忠有，何朝族. 水稻抗病基因轉(zhuǎn)入3個(gè)粳稻品種的抗性初步分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（3）：242-248.

[4] Raineri D M, Bottino P, Gordon M P, et al.- mediated transformation of rice （L.）[J]．Bio/ Technol，1990，8（1）：33-38.

[5] Chan M T, Chang H H, Ho S L, et al．- mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric alpha amylase promoter beta glucuronidase gene[J]. Plant Mol Biol, 1993, 22：491-506.

[6] Hieiy Y，Ohta S，Komari T，et al. Efficient transformation of rice （L.） mediated byand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J]. Plant J，1994，6（2）：271-282．

[7] 黃大年，朱冰，楊煒，等. 抗菌肽B基因?qū)胨炯稗D(zhuǎn)基因植株的鑒定[J]. 中國科學(xué)（C輯），1997，27（1）：55-62.

[8] 黃璐，衛(wèi)志明. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1999，32（4）：381-389.

[9] 任江萍，李磊，王新國，等. 大麥幼胚離體培養(yǎng)條件的建立[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)，2005，25（6）：25-28.

[10] 林國梁，李佳春，王興珍，等. 2,4-D和干燥處理對(duì)小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)，2012，32（5）：858-862.

[11] 陳升位，胡揚(yáng)帆，王楠，等. 切割處理和2,4-D對(duì)多棱裸大麥離體成熟胚出愈率的影響[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)，2014，34（12）：1645-1650.

[12] Lan Q，Yang J M, Hua W. Screening barley varieties with high regeneration rate using mature embryo culture[J]. Barley and Cereal Sciences，2012（2）：1-6.

[13] 陸瑞菊，黃劍華. 胚分割對(duì)大麥成熟胚離體培養(yǎng)的影響[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1990，6（3）：20-22.

[14] 王剛，陳寶剛，劉東升. 蔗糖在植物組織培養(yǎng)中的效應(yīng)[J]. 林業(yè)勘查設(shè)計(jì)，2007（1）：53-55.

[15] 徐鳳. 節(jié)節(jié)麥幼胚和成熟胚再生體系建立[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[16] 呂芝香. 碳源種類和濃度對(duì)愈傷組織生長的影響[J]. 植物生理學(xué)通訊，1981（6）：1-5.

[17] 余桂紅，張旭，孫曉波，等. 大麥蘇啤4號(hào)幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)及植株的高頻再生[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（5）：953-956.

[18] 王鋒. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐鹽基因?qū)Υ篼溣着呒捌溆鷤M織的遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[19] 郭曉琳. 大麥成熟胚高效再生體系的建立和改良直鏈淀粉的轉(zhuǎn)基因研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[20] 包文泉，馬曉璐，白玉娥，等. 西部沙櫻枝條愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化培養(yǎng)[J]. 分子植物育種，2018，16（13）：4363-4367.

[21] He T, Jia J F. High frequency plant regeneration from mature embryo explants of highland barley（L.var. nudum Hk. f.） under endosperm-supported culture [J]. Plant Cell Tissure Organ Culture，2008，95（2）：251-254.

[22] 任江萍，李磊，王新國，等. 大麥幼胚離體培養(yǎng)條件的建立[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)，2005，25（6）：25-28.

[23] 王鐠，宋家祥，付群英. 藥用植物決明的愈傷組織誘導(dǎo)與生長增值的培養(yǎng)條件研究[J]. 中草藥，1997（12）：739-742.

Study on callus induction, subculture and differentiation of mature embryo of barley

LI Chen, XIE Xiao-dong, WANG Jing-tai, CUI Chun-yang, WANG Wan-kun, CHEN Xiao-qiangCorresponding Author

（College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In this study, G1614 was used as plant materials. The effects of different concentrations of 2,4-D, different kinds and concentrations of carbon source, and different cutting ways to mature embryos on the callus induction of mature embryos from barley G1614 were studied with MS medium as basic medium. And the effects of different concentrations of KT and NAA on the differentiation of barley callus were also studied. The results showed that inducing rate of callus were higher at 5 mg/L 2,4-D. Callus induction rate of mature barley embryos using 30 g/L sucrose as carbon source was higher. The induction rate of barley callus was promoted by longitudinal cut of mature embryo. The addition of 0.5 mg/L NAA and 4.0 mg/L KT in the differentiation medium resulted in a higher differentiation rate of G1614 callus.

barley; mature embryo; callus; differentiation

S512.3

A

1008-5394（2019）02-0008-05

10.19640/j.cnki.jtau.2019.02.002

2019-03-06

天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（201801024）

李晨（1996-），女，本科在讀，研究方向：種子科學(xué)與工程。E-mail: 2450370740@qq.com。

陳小強(qiáng)（1976-），女，副教授，博士，主要從事植物細(xì)胞工程及遺傳育種相關(guān)工作。E-mail: chenxia9663@126.com。

責(zé)任編輯：宗淑萍