(廣東醫(yī)科大學(xué)東莞科研中心藥學(xué)院，廣東東莞，523808)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以認知障礙、智力減退、人格改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)[1]。流行病學(xué)研究顯示，我國65歲以上AD患者約占人群的5%，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，使中老年人的生活質(zhì)量和健康受到嚴重的影響[2]。因此，對AD的防治已成為醫(yī)療研究的重要領(lǐng)域。AD的典型病理特征是：β-淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)聚集形成老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失[3]。AD發(fā)生的主要原因之一是由于Aβ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激進而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡。氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除失衡，導(dǎo)致氧活性物質(zhì)(reactive oxygen species, ROS)在體內(nèi)堆積而導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)。大量ROS能夠引起DNA、蛋白質(zhì)及脂類等生物大分子氧化，對各種生物分子的功能和結(jié)構(gòu)造成損傷，且能改變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致細胞功能異常，甚至引起細胞凋亡。因此，抑制氧化應(yīng)激可能是治療AD的一種可行辦法。

姜黃素(Curcumin)是從姜黃中提取的一種多酚類物質(zhì)，作為天然藥物具有廣泛的藥理作用和生物學(xué)功能，如抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等[4]，近年來成為研究熱點。本研究采用PC12細胞，使用H2O2處理，建立氧化應(yīng)激損傷細胞模型，同時給予姜黃素進行干預(yù)，在PC12細胞中，探討姜黃素對H2O2引發(fā)的細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用及相關(guān)機制，以期為姜黃素的藥理藥效及其在臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與實驗分組

1.1 材料

小鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞株(上海細胞庫)；姜黃素(Sigma)；RPMI Medium1640(GIBCO)；胎牛血清(GIBCO)；特級馬血清(北京索萊寶科技有限公司)；H2O2(Sigma)；CCK-8(上海東仁化學(xué)科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 細胞培養(yǎng)

PC12細胞培養(yǎng)在包含5%胎牛血清、10%馬血清和1%青鏈酶素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)裝置為37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，隔天換液，細胞進入對數(shù)生長期后進行實驗。

1.3 實驗分組及藥物處理

取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞數(shù)至5×103個/mL接種于96孔板中，待細胞培養(yǎng)24 h貼壁生長后，棄去培養(yǎng)基。實驗分組為：正常對照組(Control)，加入完全培養(yǎng)基；H2O2模型組(H2O2)，加入終濃度為75 μM的H2O2處理細胞；姜黃素低劑量處理組、中劑量處理組、高劑量處理組，用終濃度分別為1, 10, 100 μM姜黃素預(yù)處理12 h后，再加入終濃度為75 μM的H2O2，共培養(yǎng)24 h，測定相關(guān)指標(biāo)。

2 實驗方法

2.1 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞活力的影響

按1.3項分組及藥物處理后吸去舊培養(yǎng)基，然后每孔加入10μL CCK8試劑,繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中孵育1-2 h后，置于酶標(biāo)儀中測定每孔細胞的吸光度OD值，檢測波長設(shè)置為450 nm。設(shè)定正常對照Control組的細胞存活率為100%，按下列公式計算其余各組細胞的存活率：

細胞存活率=實驗組OD平均值/正常對照OD平均值×100%

2.2 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞脂質(zhì)過氧化(MDA)影響

按1.3項分組及藥物處理后，收集細胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌2遍，4℃勻漿、離心，取上清液作為待測樣品，按照試劑盒說明書進行操作(南京建成生物工程公司)，使用酶標(biāo)儀在波長532 nm處比色定量，檢測MDA含量。

2.3 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞ROS產(chǎn)生的影響

使用還原型二氯熒光素(DCFH-DA)進行活性氧檢測。DCFH-DA進入細胞后，能夠被胞內(nèi)的酯酶水解成無熒光的DCFH，細胞內(nèi)的ROS使之氧化，生成有熒光的DCF。DCF的熒光強度反應(yīng)了胞內(nèi)ROS的水平。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μM。收集細胞，去除細胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。在倒置熒光顯微鏡下觀察攝片，每孔隨機取5個視野，Image J 1.8.0軟件分析相對光密度，再計算每組所有樣本的平均熒光強度。

2.4 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)影響

細胞勻漿，取上清，按照試劑盒說明書(南京建成生物工程公司)進行SOD、CAT及GSH-Px活性測定，利用用酶標(biāo)儀比色定量，測定SOD、CAT及GSH-Px活性。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用Mean±SD表示，所有實驗每組均重復(fù)3次以上，結(jié)果采用單因素方差分析和student's t檢驗進行統(tǒng)計分析。p<0.05為對比組之間差異有顯著性意義。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞細胞活性降低

如圖1所示，在PC12細胞中，不同濃度姜黃素預(yù)處理12 h，對H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷呈劑量依賴性的保護，即隨著姜黃素濃度增加，其對PC12細胞的保護作用增強。表明，在PC12細胞中，姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激損傷。

圖1 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)PC12細胞的損傷的作用影響

3.2 姜黃素抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞脂質(zhì)過氧化(MDA)的產(chǎn)生

MDA是脂質(zhì)過氧化重要產(chǎn)物之一。實驗結(jié)果顯示，與Control組細胞相比,H2O2模型組細胞MDA含量明顯增加(P<0.05)。與H2O2模型組細胞相比，姜黃素預(yù)處理組可以明顯降低H2O2導(dǎo)致的PC12細胞的MDA產(chǎn)生，且呈劑量依賴性抑制。實驗結(jié)果表明，在PC12細胞中，姜黃素能夠抑制H2O2引起的細胞脂質(zhì)過氧化。

圖2 姜黃素對H2O2引起的PC12細胞脂質(zhì)過氧化的影響

3.3 姜黃素抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞ROS的產(chǎn)生

對各組細胞胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生進行檢測，結(jié)果如圖3顯示，H2O2能夠誘導(dǎo)PC12細胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，與Control組細胞相比有顯著性差異(p<0.01)；而姜黃素預(yù)處理組可以明顯逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，且具劑量依賴性，提示姜黃素能夠抑制H2O2所致的氧化應(yīng)激損傷。

圖3 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞ROS的影響

3.4 姜黃素對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)影響

如表1所示，在PC12細胞中，H2O2可顯著降低細胞SOD、CAT及GSH-Px活性，與Control組相比明顯降低(p<0.01)，姜黃素可呈劑量依賴性增加SOD、CAT及GSH-Px活性，與模型組相比有顯著性差異(p<0.05)。以上結(jié)果提示姜黃素通過提高抗氧化酶系活性來減輕H2O2所致的氧化應(yīng)激損傷。

4 討論

AD致病機制中Aβ級聯(lián)反應(yīng)是的重要的假說之一。Aβ聚集可以引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使ROS增多。而進一步，氧化應(yīng)激又會促進Aβ聚集，并且促進微管相關(guān)蛋白tau蛋白磷酸化，使AD大腦中的氧化還原反應(yīng)失衡加重。AD患者的腦組織標(biāo)本及轉(zhuǎn)基因鼠標(biāo)本都表明，Aβ形成增多與腦組織氧化應(yīng)激水平增高呈正相關(guān)。研究表明，上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶在抑制Aβ誘導(dǎo)的氧化損傷中發(fā)揮積極作用[5,6]，使其成為AD治療的新靶標(biāo)。因此，誘導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化酶活性能潛在地增強細胞的抗氧化能力，進而改善氧化應(yīng)激相關(guān)性疾病。本研究利用H2O2誘導(dǎo)PC12細胞，建立體外AD氧化應(yīng)激模型，通過CCK-8法檢測細胞活力的變化，發(fā)現(xiàn)在各劑量姜黃素預(yù)處理之后，各組細胞活力明顯高于H2O2模型組，表明姜黃素對H2O2誘導(dǎo)PC12細胞具有較好的保護作用，減輕了H2O2引起的細胞損傷程度。ROS是氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物，本實驗通過DCFH-DA探針發(fā)現(xiàn)，H2O2模型組的ROS產(chǎn)生較多，其氧化應(yīng)激程度要遠高于正常組細胞，而在姜黃素干預(yù)后，PC12細胞內(nèi)的ROS強度顯著下降，氧化應(yīng)激水平降低，從而對神經(jīng)起到了保護作用。MDA是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志產(chǎn)物，其含量能夠間接顯示細胞受過氧化損傷程度。本實驗結(jié)果顯示，H2O2模型組中MDA含量較多，與模型組相比，姜黃素給藥組MDA含量明顯降低，表明姜黃素能夠改善H2O2的氧化損傷。

表1 姜黃素對H2O2引起的PC12細胞抗氧化酶系活性變化的影響

注：**p<0.05，與空白對照組比；##p<0.05，與模型組比

生物體自身具有抗氧化防御系統(tǒng)能夠抵御ROS所引致的氧化傷害。例如，超氧歧化酶(Super oxidase, SOD)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSHPx)等內(nèi)源性抗氧化酶。SOD廣泛分布于生物體各種組織中，可以轉(zhuǎn)化有害的超氧自由基為H2O2，進而使細胞免受氧化應(yīng)激損傷，是非常重要的生物體內(nèi)的抗氧化酶[7]。CAT廣泛分布于各類組織中，可以催化過氧化氫分解成氧和水，從而對機體起到保護作用[8]。GSH-Px能夠使有毒的過氧化物還原成無毒的化合物，同時促進過氧化氫分解成氧和水，從而使細胞功能和結(jié)構(gòu)完整[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制H2O2引起的PC12細胞中SOD、CAT及GSH-Px酶活力降低，進而在保護細胞抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷中發(fā)揮積極作用。

5 結(jié)論

綜上所述，PC12細胞中，姜黃素預(yù)處理能夠保護H2O2誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激損傷。姜黃素能夠使脂質(zhì)過氧化損傷降低并抑制胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，此外，能夠使抗氧化酶系的活力增加，進而實現(xiàn)其對神經(jīng)氧化應(yīng)激損傷的保護作用。這些研究為姜黃素能夠防治AD等氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病提供一定的依據(jù)，但是其在分子水平的作用機理及對人體的作用還有待進一步研究。