王蘇湘 滕朝宇 吳 瑕 王 宇

據(jù)中國醫(yī)院管理協(xié)會(huì)2008年年底統(tǒng)計(jì)，我國大陸地區(qū)共有102863例慢性透析患者，患病率為79.1/100萬人口，年患病率為52.9%，其中有89.5%的患者接受血液透析治療[1]。2017年8月4日第九屆中國血液凈化論壇報(bào)告表明，目前我國慢性腎臟病患者超過1.2億，其中3期以上約1800萬(占0.13%)。原國家衛(wèi)計(jì)委“鼓勵(lì)獨(dú)立的血透中心開展血液透析治療”的文件發(fā)布以來，開展血液透析治療的機(jī)構(gòu)快速增加，保障治療安全等工作迫在眉睫。

開展血透治療時(shí)，透析液的配制、透析機(jī)的沖洗、透析器及血路管道用水都要求使用無菌的去離子反滲透(reverse osmosis，RO)水，即透析用水。傳統(tǒng)透析治療需要水120～180 L，高通量透析會(huì)消耗更多的水，而透析用水的水質(zhì)直接關(guān)系到透析的遠(yuǎn)期效果[2]。為避免不合格水質(zhì)對患者的不良反應(yīng)，透析用水必須嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制。否則，一旦細(xì)菌或化學(xué)性物質(zhì)進(jìn)入人體會(huì)引起并發(fā)癥，透析用水的衛(wèi)生質(zhì)量關(guān)系到眾多腎功能衰竭患者的身體健康和生存質(zhì)量。因此，微生物及內(nèi)毒素污染的防控、規(guī)范透析用水、透析濃縮液和透析液的質(zhì)量十分重要。

1 內(nèi)毒素與血液凈化

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的類脂多糖體(脂多糖)，在細(xì)菌死亡后裂解釋放出來。內(nèi)毒素能與血管壁細(xì)胞膜結(jié)合，改變血管通透性，使血壓下降導(dǎo)致休克。內(nèi)毒素水解后可以穿過透析膜進(jìn)入到患者的體內(nèi)，導(dǎo)致急性熱源性反應(yīng)，使患者產(chǎn)生低血壓、肌肉痙攣、頭痛及發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重的可導(dǎo)致休克或內(nèi)毒素血癥[3]。

1.1 內(nèi)毒素與鱟試劑法

鱟試劑法是目前測定內(nèi)毒素的主要方法，該方法檢測內(nèi)毒素特異性強(qiáng)、靈敏度高且操作方法簡便，美國藥典(USP)和中國藥典(CP)均已收載[4]。檢測方法有凝膠法和光度測定法，光度測定法又包括濁度法和顯色基質(zhì)法。鱟試劑中的C因子能夠與內(nèi)毒素反應(yīng)，激活B因子，活化后的B因子使凝固酶原變成凝固酶，凝固蛋白原在凝固酶的作用下形成凝固蛋白，最終形成凝膠。

1.2 內(nèi)毒素污染來源

與透析有關(guān)的內(nèi)毒素污染來源[5]主要包括以下4個(gè)方面。

(1)水前處理系統(tǒng)。透析用水的處理系統(tǒng)包括沉淀過濾器、軟水器、活性碳過濾器等水質(zhì)前處理系統(tǒng)，以及逆滲透膜系統(tǒng)或去離子器和超過濾器等。

(2)反滲水輸送管道。管徑大小、材質(zhì)和結(jié)構(gòu)的不同會(huì)造成細(xì)菌滋生，甚至?xí)纬缮锬じ街诠苈返谋砻娑欣?xì)菌的滋生，污染復(fù)用用水。

(3)透析濃縮液配制的過程環(huán)節(jié)，透析濃縮液的污染，重碳酸鹽透析液非常容易滋長細(xì)菌。

(4)透析機(jī)的污染，上下機(jī)及兩班連臺(tái)之間的消毒控制。

1.3 內(nèi)毒素超標(biāo)的臨床表現(xiàn)

血液透析設(shè)備系統(tǒng)消毒過程中透析用水、透析濃縮液及透析液內(nèi)毒素超標(biāo)會(huì)將內(nèi)毒素帶入尿毒癥患者血液，導(dǎo)致尿毒癥患者產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素作用于吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、補(bǔ)體系統(tǒng)以及凝血系統(tǒng)，并誘生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-a)、白細(xì)胞介素-1(interleukin，IL-1)、IL-6和IL-8、組胺以及激肽等生物活性物質(zhì)，使組織器官毛細(xì)血管灌注不足，出現(xiàn)缺氧及酸中毒等。高濃度的內(nèi)毒素也可激活補(bǔ)體替代途經(jīng)，引發(fā)高熱、低血壓以及活化凝血系統(tǒng)，最后導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血。嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致微循環(huán)衰竭和低血壓為特征的內(nèi)毒素休克甚至死亡。發(fā)現(xiàn)后要檢查原因，感染者應(yīng)給予抗感染治療[6-7]。

2 研究材料與方法

應(yīng)用戴明循環(huán)(plan do check action，PDCA)動(dòng)態(tài)循環(huán)方法管理血液透析內(nèi)毒素濃度含量控制過程，制定有效管控計(jì)劃，嚴(yán)格執(zhí)行，對出現(xiàn)的問題應(yīng)具備解決方案和處理措施；并形成記錄，實(shí)現(xiàn)菌毒共控、醫(yī)療安全的目的[8-9]。

2.1 檢測樣本及樣品收集

(1)采集2014年1月至2017年8月常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液凈化中心的透析用水、透析濃縮液及透析液檢測樣本。

(2)將透析濃縮液連接至血液透析機(jī)，機(jī)器進(jìn)入自檢狀態(tài)。待血液透析機(jī)的自檢程序結(jié)束以后，安裝一次性透析器和透析管路，將透析液快速接頭按照要求連接到透析器，透析液由下向上進(jìn)入透析器；關(guān)閉透析液，取下透析器透析液入口的快速接頭。將快速接頭開口向上，打開透析液開關(guān)后透析液自然流出。將取樣吸管或注射器插到快速接頭底部取樣，注意吸頭不可碰到快速接頭密封圈外側(cè)。透析用水及透析濃縮液采樣，用絡(luò)合碘擦拭控制閥出液口，沖洗干凈后再提取供試樣本。

2.2 儀器與試劑

采用ELx808IULALXH型鱟試驗(yàn)微生物快速檢測儀(美國威諾斯基Bio-Tek公司)；渦旋振蕩儀(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)。透析專用鱟試劑檢測試劑盒(0.25 EU/ml，Lot No 130725，Lot No 140825)、透析專用鱟試劑檢測試劑盒(0.5 EU/ml，Lot No 120916，Lot No 140705)、透析專用鱟試劑檢測試劑盒(2 EU/ml，Lot No 130620，Lot No 140825，Lot No 151201)和動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑盒(Lot No 180627B)均來源于廈門鱟試劑生物科技股份有限公司。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，無熱原吸頭，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，無熱原板條，無熱原接收管。

2.3 透析相關(guān)細(xì)菌內(nèi)毒素限值

(1)根據(jù)國家醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《血液透析及治療相關(guān)用水》(YY 0572-2015):透析用水的內(nèi)毒素含量應(yīng)≤0.25 EU/ml[10]。美國醫(yī)療儀器促進(jìn)協(xié)會(huì)(The Association for the Advancement of Medical Instrumentation，AAMI)采用2EU/ml的水平作為內(nèi)毒素的上限值[11]。歐洲藥品質(zhì)量管理局(European Directorate for the Quality of Medicines &HealthCare，EDQM)規(guī)定0.25 EU/ml為內(nèi)毒素的上限值。國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)在ISO13959:2009標(biāo)準(zhǔn)2008年的修訂過程中，0.25 EU/ml的限值被列入作為透析用水內(nèi)毒素的上限值。

(2)根據(jù)國家醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《血液透析及相關(guān)治療用濃縮物》(YY 0598-2015):濃縮物以細(xì)菌內(nèi)毒素用水配制成透析液后，透析濃縮液的內(nèi)毒素限量應(yīng)＜0.5 EU/ml[12]。

(3)根據(jù)原國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)2010版《血液凈化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》，透析液內(nèi)毒素限量＜2 EU/ml[13]。

2.4 凝膠法檢測內(nèi)毒素(透析專用鱟試劑)

(1)陰性對照溶液的制備。即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(TAL reagent water，TRW)。

(2)陽性對照溶液的制備。濃度為2λ的內(nèi)毒素溶液(λ為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度)。

(3)樣本溶液的制備。用無熱原采樣瓶收集適量的透析用水或透析液。按鱟試劑的靈敏度(λ)及樣本的內(nèi)毒素限值(L)計(jì)算樣品的最大有效稀釋倍數(shù)(maximum allowable dilution，MVD)，其計(jì)算為公式1:

(4)樣本陽性對照溶液的制備。含2λ內(nèi)毒素的樣本溶液或稀釋后樣本溶液。

(5)實(shí)驗(yàn)操作。從試劑盒內(nèi)取出8支鱟試劑，開啟，設(shè)置檢查項(xiàng)目及加樣見表1。

表1 設(shè)置檢查項(xiàng)目及加樣(ml/管)

加樣完畢，封閉管口，輕輕搖勻混合液，放入37 ℃的恒溫水浴鍋溫育60 min，溫育期間避免振動(dòng)。

(6)結(jié)果判斷。將安瓿從恒溫水浴鍋中輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180°。若安瓿內(nèi)的內(nèi)容物呈堅(jiān)實(shí)凝膠，不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為(+)；不呈凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(-)。

(7)當(dāng)陰性對照管結(jié)果均為陰性，陽性對照管和樣品陽性對照管為陽性，實(shí)驗(yàn)有效，否則無效，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 動(dòng)態(tài)濁度法檢測內(nèi)毒素

(1)程序設(shè)置。①儀器預(yù)熱，設(shè)置孵育溫度為37 ℃；②振板設(shè)定為中速，振板5 s；③動(dòng)力學(xué)參數(shù)設(shè)定，讀板120 min，讀板間隔30 s，檢測波長為630 nm。

國際關(guān)系史的經(jīng)驗(yàn)證明，文化差異是影響國家間深入合作的隱形溝壑，是導(dǎo)致國家間信任缺失的重要因素之一?！拔幕g良性的交流與合作可以增進(jìn)各國間友好關(guān)系的發(fā)展”，“不同文化間的良性互動(dòng)關(guān)系不僅有利于文化發(fā)展，而且有利于國家間關(guān)系趨穩(wěn)、趨善?！盵5]因此，加強(qiáng)中國與中亞國家之間的互信與合作，必須要跨越文化差異的障礙。文化的傳播、交流與互動(dòng)是促成文化間開展對話、達(dá)成文化和解與包容的重要途徑。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制備成5個(gè)濃度的稀釋液，相鄰濃度間稀釋倍數(shù)≤10倍，最低濃度不低于所用鱟試劑的標(biāo)準(zhǔn)檢測限。取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，加入1.0 ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，渦旋振蕩15 min，將其稀釋配制成0.005 EU/ml、0.01 EU/ml、0.1 EU/ml、1 EU/ml和10 EU/ml的5種濃度的反應(yīng)溶液，陰性對照為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。每個(gè)濃度點(diǎn)測3個(gè)平行，陰性對照測兩個(gè)平行。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品檢測。取每個(gè)濃度點(diǎn)的內(nèi)毒素溶液各0.1 ml或樣品0.1 ml與0.1 ml鱟試劑反應(yīng)。鱟試劑的準(zhǔn)備:用移液器準(zhǔn)確吸取細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1.7 ml，沿瓶壁加入西林瓶內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物全部溶解(避免產(chǎn)生氣泡)。

(4)數(shù)據(jù)處理。設(shè)定啟動(dòng)OD(一般設(shè)定為0.02)，軟件自動(dòng)給出啟動(dòng)時(shí)間。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線為公式2:

式中y為啟動(dòng)時(shí)間的對數(shù)值，x為內(nèi)毒素濃度的對數(shù)值，a為直線斜率，b為y軸截距。

當(dāng)陰性對照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)｜r｜≥0.980，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

3 結(jié)果

3.1 透析專用鱟試劑(凝膠法)檢測

2014-2017年采用3種規(guī)格透析專用內(nèi)毒素凝膠法檢測試劑盒檢測結(jié)果見表2。

表2 透析用水、透析濃縮液及透析液內(nèi)毒素檢測結(jié)果

3.2 動(dòng)態(tài)濁度法檢測

內(nèi)毒素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線中Y=-0.2593X+2.938 r=0.997，見圖1。

圖1 內(nèi)毒素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表3 供試液樣品的內(nèi)毒素濃度檢測值

采用定量檢測法—?jiǎng)討B(tài)濁度法檢測試劑盒結(jié)合專業(yè)設(shè)備Elx808IULALXH檢測反滲水、透析液、置換液以及反滲水出(回)水口的內(nèi)毒素濃度值見表3。

表3結(jié)果表明，出口反滲水和反滲水回水口的內(nèi)毒素值偏高，應(yīng)立即進(jìn)行消毒。

4 討論

臨床透析單位內(nèi)毒素檢測普遍采用凝膠法，雖然此法操作簡單，結(jié)果一目了然。但也存在一些不足:①無法掌控合格值下的趨勢變化，試劑精密度較差，靈敏度誤差為0.5～2；②凝膠法鱟試劑根據(jù)凝膠的形成情況，用肉眼判斷陰陽性，容易造成假陽性、假陰性的判斷結(jié)果，對技術(shù)水平要求高。

臨床上有時(shí)需要對內(nèi)毒素的濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，凝膠法無法精準(zhǔn)定量，應(yīng)當(dāng)選擇動(dòng)態(tài)濁度法。近年來，大中型透析中心逐漸開始應(yīng)用定量分析方法檢測透析用水、透析濃縮液和透析液的內(nèi)毒素濃度。動(dòng)態(tài)濁度法與凝膠法的反應(yīng)原理相同，是根據(jù)鱟試劑在形成凝膠的過程中反應(yīng)液渾濁度上升的速度和反應(yīng)液中內(nèi)毒素濃度成比例的原理所設(shè)計(jì)的定量法鱟試劑，靈敏度高達(dá)0.005 EU/ml，檢測范圍寬，可根據(jù)樣本的限值和微生物的生長曲線及樣本監(jiān)測趨勢定出檢測樣本的預(yù)警區(qū)間。

37 ℃為鱟試驗(yàn)最優(yōu)條件，但實(shí)驗(yàn)對溫度非常敏感，所以設(shè)備溫控的精準(zhǔn)度是實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的重要條件[14]。定量檢測法—?jiǎng)討B(tài)濁度法所需儀器為帶溫育系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)光度測定儀器及配套軟件，如全進(jìn)口的ELx808IULALXH為各大國內(nèi)外公司常用及推薦的內(nèi)毒素定量檢測設(shè)備，帶有4-Zone溫控專利。設(shè)備要能符合ISO15189認(rèn)證，抗干擾能力強(qiáng)，溫控精度高，光路系統(tǒng)精確度、靈敏度穩(wěn)定；實(shí)現(xiàn)批量微量化微板檢測、自動(dòng)化檢測；符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good manufacturing practice，GMP)及美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)要求，保障準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

內(nèi)毒素檢測由醫(yī)院檢驗(yàn)中心及院外有資質(zhì)的第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)執(zhí)行，實(shí)際操作時(shí)有許多因素會(huì)影響內(nèi)毒素檢測結(jié)果。對于透析濃縮液早期出現(xiàn)過陽性不合格結(jié)果，從影響內(nèi)毒素檢測結(jié)果的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié)查找風(fēng)險(xiǎn)因素及原因發(fā)現(xiàn)，濃縮液B液攪拌桶以及B液成品桶微生物指標(biāo)超標(biāo)，針對性采取提高消毒頻次，采用多種消毒手段相結(jié)合的措施，抑制微生物生長達(dá)到有效控制內(nèi)毒素的質(zhì)量控制目的。

臨床上有些數(shù)據(jù)提示，在使用透析液時(shí)需要對其進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。經(jīng)過透析治療的患者，其內(nèi)毒素水平并不能馬上降低，甚至短時(shí)間內(nèi)會(huì)有所上升[15-6]。具體表現(xiàn):①患者治療第1 d的內(nèi)毒素含量為0.95 EU/ml，與正常人相比其數(shù)值具有顯著差異(正常人內(nèi)毒素含量為0.13±0.07 EU/ml)；②治療第3 d，內(nèi)毒素含量上升至1.63 EU/ml，直到治療第7 d，內(nèi)毒素含量降至0.65 EU/ml，與未經(jīng)治療的患者相比，數(shù)值具有顯著差異，未經(jīng)治療的患者內(nèi)毒素含量在第7 d為1.03 EU/ml；③透析液的貯存時(shí)間也會(huì)影響血透效果，甚至季節(jié)變化到溫度較為適中的月份都會(huì)加快革蘭氏陰性菌的生長繁殖[17-18]。因此，血透室要注意配液時(shí)間、配液濃度及保存時(shí)間等質(zhì)量進(jìn)行控制，這主要是因?yàn)橥肝鍪褂玫耐肝鲆菏窃谑覝叵卤４?，且多次使用于血液透析，透析過程經(jīng)常未加蓋，透析液處于開放狀態(tài)，盛放透析液的器皿未經(jīng)消毒處理，上述因素使得透析液受到污染，細(xì)菌大量繁殖。

5 結(jié)論

動(dòng)態(tài)濁度法測試的結(jié)果明確顯示出透析系統(tǒng)某些環(huán)節(jié)內(nèi)毒素的動(dòng)態(tài)變化，如反滲水管路入口和出口，以及回路的內(nèi)毒素?cái)?shù)值的變化，從而制定相應(yīng)的解決方案，指導(dǎo)臨床透析的環(huán)節(jié)質(zhì)量控制，以提高透析系統(tǒng)的安全性。臨床透析工程學(xué)質(zhì)量控制需按下述要求進(jìn)行。

(1)經(jīng)常對反滲透機(jī)、供水管路及透析機(jī)進(jìn)行聯(lián)動(dòng)消毒。根據(jù)表3的結(jié)果，反滲水、出口反滲水、入口反滲水以及反滲水出(回)水口的內(nèi)毒素檢測均超標(biāo)，表明應(yīng)當(dāng)提高檢測頻次，而有利于預(yù)測內(nèi)毒素的預(yù)警區(qū)間。消毒時(shí)使消毒液充滿系統(tǒng)每個(gè)部分，并保持必要的時(shí)間，以達(dá)到良好的消毒效果。具有熱消毒功能的反滲透機(jī)、供液管路及透析機(jī)，建議至少每周進(jìn)行1次聯(lián)動(dòng)熱消毒。

(2)在透析機(jī)上加裝超凈濾器(內(nèi)毒素濾器)，能阻止透析系統(tǒng)中細(xì)菌和內(nèi)毒素的通過，從而有效地降低細(xì)菌及內(nèi)毒素對透析系統(tǒng)的污染，是一種十分有效的方法。目前各大醫(yī)院有不同國內(nèi)外品牌透析機(jī)，工藝參差不齊，導(dǎo)致內(nèi)毒素污染風(fēng)險(xiǎn)加大，建議提高透析機(jī)與出水口連接裝置內(nèi)毒素檢測頻次。

(3)自行配制透析液單位，采用人工、機(jī)械攪拌等方式，透析液B濃縮液現(xiàn)用現(xiàn)配，不使用剩余濃縮液。建議使用無菌B濃縮液或聯(lián)機(jī)B干粉。復(fù)用的B液成品桶應(yīng)每日使用反滲水沖洗、倒置，周期性消毒和更換。

(4)集中配供濃縮液系統(tǒng)的配液間應(yīng)安裝空調(diào)及通風(fēng)設(shè)施和洗手盆，同時(shí)應(yīng)安裝空氣殺菌裝置抑制細(xì)菌滋生；配液、供液系統(tǒng)相關(guān)容器、管道消毒抑菌控毒應(yīng)遵從設(shè)備生產(chǎn)商的維護(hù)要求實(shí)施[19]。

患者進(jìn)行血液透析時(shí)，如果透析用水和透析液被微生物污染，則會(huì)導(dǎo)致多種并發(fā)癥，甚至直接威脅到患者的生命。一旦水解后的內(nèi)毒素穿過透析膜進(jìn)入患者體內(nèi)，便會(huì)產(chǎn)生熱源性反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)低血壓、發(fā)熱、肌肉痙攣等癥狀，嚴(yán)重時(shí)直接導(dǎo)致休克。因此，進(jìn)行血液透析系統(tǒng)內(nèi)毒素檢測與控制是必不可少的重要環(huán)節(jié)。