何潔靜 鄒秀敏 呂 楊

降鈣素原(procalcitonin，PCT)是降鈣素的多肽前體，正常情況下PCT產(chǎn)生于甲狀腺C細胞染色體11上的Calc-1基因。由于在甲狀腺C細胞中產(chǎn)生的PCT絕大多數(shù)轉(zhuǎn)化成降鈣素，因此在健康人體內(nèi)PCT的含量非常低(＜0.05 ng/ml)[1]。PCT在全身炎癥反應(yīng)后的2～4 h時開始升高，12～24 h達到峰值[2]。PCT在血樣中非常穩(wěn)定，采血后在室溫下放置24 h，PCT質(zhì)量濃度僅下降12%左右，如果在4 ℃保存僅下降6%。冰凍、抗凝劑、血清或者血漿、動脈血或者靜脈血對檢測結(jié)果的影響均微乎其微。PCT對于感染早期的診斷、感染類型的鑒別和程度的判定、感染疾病的分層治療和預(yù)后評估以及指導(dǎo)抗生素使用等方面有很高的價值[3-8]。

即時檢測(point of care testing，POCT)設(shè)備因為體積很小，便于攜帶，操作方式簡單，檢測結(jié)果即時顯示，為診斷和治療節(jié)省了寶貴的時間，從而降低患者致殘率和病死率，可以在各種復(fù)雜環(huán)境下例如救護車內(nèi)、急診室、患者家中甚至偏遠戶外使用[9-10]。

近年來，POCT是體外診斷行業(yè)增長最為快速的分支，目前市場上能夠檢測PCT的POCT產(chǎn)品很多，其主流的方法學(xué)有免疫熒光分析法、膠體金免疫層析法和基于微流控芯片的磁敏免疫法等[11-14]。其中磁敏免疫法運用了磁敏生物芯片及主動微流控兩大關(guān)鍵技術(shù)，實現(xiàn)高精度的檢測，文章參照美國臨床和實驗室標(biāo)準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP17-A文件的要求，對磁敏免疫分析儀及其配套PCT檢測試劑進行最低檢出限、準確度、精密性、線性范圍、抗干擾性及方法學(xué)比對評估。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

(1)Cobas e411電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀(羅氏公司，以下簡稱羅氏e411)；m16磁敏免疫分析儀(深圳市理邦精密儀器股份有限公司，以下簡稱理邦m16)。

(2)降鈣素原檢測試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)，100測試/盒，批號23285903；降鈣素原測定試劑盒(磁敏免疫法)，25人份/盒，批號20180523。

1.2 檢測標(biāo)本

收集2018年5-6月解放軍聯(lián)勤保障部隊第928醫(yī)院64份臨床背景清晰的門診及住院患者4 h內(nèi)采集的新鮮血清標(biāo)本，包含不同濃度梯度，用于方法學(xué)比對評估。

1.3 檢測方法

磁敏免疫法的檢測。結(jié)合鏈霉親和素-生物素體系的雙抗體夾心免疫反應(yīng)，將PCT抗體包被在巨磁阻芯片上，進行包被抗體→樣本抗原→標(biāo)記抗體的夾心反應(yīng)，標(biāo)記抗體上修飾有生物素，可以與結(jié)合了鏈霉親和素的超順磁納米顆粒反應(yīng)，磁顆粒被固定在芯片表面，利用磁敏傳感器對芯片上磁顆粒產(chǎn)生的磁信號進行檢測，根據(jù)磁信號的強弱判斷樣本中PCT抗原的含量。

1.4 主要分析參數(shù)

(1)最低檢出限評價。最低檢測限(limit of detection，LoD)，參考EP17-A文件[15]在磁敏免疫分析儀上對空白樣本進行檢測，測定20次，得到20次測試結(jié)果，計算其平均值(MB)和標(biāo)準差(SDB)，空白限(limit of blank， LoB)=MB+1.645 SDB，計算出LoB。采用PCT標(biāo)準抗原，用空白樣本稀釋配制5份濃度近似檢出限的低值樣本，對5份濃度近似檢出限的低值樣本進行檢測，每份樣本測定5次，對檢測結(jié)果按照大小進行排序，計算Cβ和標(biāo)準差(SDS)，最低LoD=LoB+Cβ·SDS，計算出最低LoD，如果低值樣本測定的所有25個結(jié)果中小于空白限LoB的數(shù)目≤3個，認為檢出限和空白限的設(shè)置合理。定量檢出限(limit of quantity， LoQ)定義為樣品中可以準確定量測定的最低分析物濃度，參照EP17-A文件將檢測樣本(0.1 ng/mL)做系列稀釋后的低值樣品，連續(xù)測定25次，評估系統(tǒng)偏倚應(yīng)不高于指定偏倚±15%，精密度(CV)＜15%。。

(2)準確度評價。參考EP15-A2文件[16]采用PCT標(biāo)準抗原，用陰性樣本分別稀釋至0.5 ng/ml、2 ng/ml和30 ng/ml，對同一樣品作雙份測量，共做5 d。計算95%置信區(qū)間(confidence interval，95%CI)的驗證區(qū)間，如果驗證區(qū)間包括標(biāo)示值，則驗證通過。

(3)精密性評價。參考EP5-A2文件[17]采用PCT標(biāo)準抗原，用陰性樣本分別稀釋至0.5 ng/ml和5 ng/ml，每日進行2個批次的測試，每批測試時對同一樣品作雙份測量，共進行20 d。評估結(jié)束時共有40對，即80個測試結(jié)果，計算批內(nèi)精密度和批間精密度。

(4)線性范圍評價。參考EP6-A文件[18]將高、低值樣本按比例混合，得濃度分別為0.01 ng/ml、0.5 ng/ml、2 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml的5個濃度水平的線性范圍驗證樣本，對每份樣本平行測定4次，對測試值和理論值進行線性回歸分析。

(5)抗干擾能力評價。參考文件EP7-A2文件[19]評估的干擾物為血紅蛋白、膽紅素、甘油三脂、生物素、類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體和人抗動物抗體等7種。選擇兩個不同濃度水平的樣本作為基礎(chǔ)樣本，向基礎(chǔ)樣品溶液中添加不同濃度的干擾物評估其對PCT檢測的影響。

(6)方法學(xué)比對。參考文件EP9-A2文件[20]對64份臨床血清樣本分別用理邦m16磁敏免疫分析系統(tǒng)、羅氏e411電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)定量檢測PCT，以檢驗科羅氏測試結(jié)果為參照，分別進行相關(guān)、回歸、偏差及一致性分析。

1.5 方法學(xué)比對評價

針對兩種檢測體系的結(jié)果，以羅氏e411電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)結(jié)果為對照，分別采用相關(guān)、直線回歸、Bland-Altman差異分析和一致性分析等方法進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0和Medcalc15.2.2軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計算計量資料統(tǒng)計均數(shù)、方差、標(biāo)準差和精密度，線性范圍采用最小二乘法線性回歸；兩種定量測定結(jié)果之間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析(或Spearman rank相關(guān)分析)；回歸分析運用Passing-Bablok直線回歸分析，系統(tǒng)間差異性分析用Bland-Altman分析，陰陽一致性采用四表格法統(tǒng)計，計算陰性、陽性符合率并進行Kappa檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最低LoD驗證

最低LoD驗證結(jié)果顯示，理邦m16磁敏免疫分析儀檢測PCT的LoB=MB+1.645 SDB(其中，MB為20次空白樣本檢測均值，SDB為空白樣本檢測標(biāo)準差)，LoB計算值為0.005 ng/ml。通過對5份濃度近似LoD的低值樣本進行檢測，最低LoD=LoB+Cβ×SDS(其中，SDS為多個低濃度樣品的綜合標(biāo)準差，Cβ為標(biāo)準正態(tài)分布第95%百分位數(shù)值的校正因子，Cβ=1.645/(1-1/4f)，f為SDS的自由度)，LoD計算值為0.008 ng/ml，符合廠商聲稱的最低LoD標(biāo)準，低值樣本測定的所有25個結(jié)果中小于LoB的數(shù)目＜3個，認為檢出限和LoB的設(shè)置合理。

LoQ研究結(jié)果顯示，通過對系列濃度的樣本測定，樣本濃度達到0.06 ng/ml時，系統(tǒng)的準確度偏差為13.2%，小于廠商規(guī)定的偏倚±15%；精密度為14.6%，小于廠商聲稱的精密度≤15%，因此LoQ為0.06 ng/ml。

2.2 準確度驗證

準確度驗證結(jié)果顯示，系統(tǒng)對PCT項目的檢測低、中、高(濃度分別為0.5 ng/ml、2 ng/ml和30 ng/ml)水平的各10次檢測，驗證區(qū)間分別為0.42～0.57 ng/ml、1.79～2.25 ng/ml(27.4～32.1 ng/ml，標(biāo)示值0.5 ng/ml、2 ng/ml和30 ng/ml均包含在驗證區(qū)間內(nèi)，符合廠商聲稱的要求，準確度可靠。

2.3 精密度驗證

同一組操作者在磁敏免疫分析儀上對PCT濃度分別為0.5 ng/ml和5 ng/ml的樣本進行重復(fù)測定，每日進行2個批次的測試，每批測試時，對同一樣品作雙份測量，持續(xù)進行20 d檢測，0.5 ng/ml水平下PCT的批內(nèi)精密度為5.65%，批間精密度為6.41%；5 ng/ml水平下，PCT的批內(nèi)精密度為4.77%，批間精密度為5.46%，精密度滿足臨床要求。

2.4 線性范圍驗證

在0.01～50 ng/ml范圍內(nèi)，經(jīng)相關(guān)性分析得相關(guān)系數(shù)r＞0.99(P＜0.0001)，PCT實測值與理論值呈顯著正相關(guān)；回歸方程為Y=0.9785X+0.0506，R2＞0.99，斜率b的95%置信區(qū)間為0.9724～0.9845，截距a的95%CI為-0.0874～0.1888，與0的差異檢驗無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.1676，P=0.3273)，與說明書描述的線性范圍0.01～50 ng/ml相符，驗證合格。

2.5 抗干擾能力評價

干擾試驗驗證結(jié)果表明:血紅蛋白對試劑盒的干擾濃度臨界值為5000 mg/dl；膽紅素對試劑盒的干擾濃度臨界值為15 mg/dl；甘油三脂對試劑盒的干擾濃度臨界值為3000 mg/dl；類風(fēng)濕因子對試劑盒的干擾濃度臨界值為200 IU/ml；噬異性抗體對試劑盒的干擾濃度臨界值為抗體滴度1:64；生物素對試劑盒的干擾濃度臨界值為10 mg/dl；人抗鼠抗體對試劑盒的干擾濃度臨界值為50 pg/ml，低于上述臨界值時不會對檢測值產(chǎn)生顯著干擾。

2.6 相關(guān)分析

磁敏免疫法(理邦m16)檢測PCT的結(jié)果與對照結(jié)果相關(guān)系數(shù)＞0.9，其中理邦m16系統(tǒng)與對照的相關(guān)系數(shù)＞0.99。相關(guān)性結(jié)果見表1。

表1 理邦m16與羅氏e411測定結(jié)果相關(guān)分析

2.7 回歸分析

線性回歸方程為Y=-0.006+0.993X，二系統(tǒng)的決定系數(shù)＞0.99。線性回歸結(jié)果見表2，回歸直線見圖1。

圖1 兩系統(tǒng)測定結(jié)果回歸直線及散點圖

2.8 Bland-Altman差異分析

理邦m16系統(tǒng)樣本濃度測試結(jié)果與對照結(jié)果相對偏差的一致性界限(limit of agreement，LoA)為[-25，19.0]，LoA下限-25的95%CI為[-29.9～20.1]，上限19.0的95%CI為[14.1～23.9]，綜合的LoA為[-29.9，23.9]，平均偏差為-3.0%，最大偏差＜±30%，滿足血清降鈣素原室間質(zhì)評±30%的要求。Bland-Altman差異分析結(jié)果見表3、圖2。

表2 兩系統(tǒng)測定結(jié)果回歸分析統(tǒng)計

表3 兩系統(tǒng)測定結(jié)果的Bland-Altman分析統(tǒng)計

圖2 兩系統(tǒng)測定結(jié)果的Bland-Altman圖

2.9 一致性分析

根據(jù)PCT急診臨床應(yīng)用的專家共識[21]分別評價Cut-off值為0.5 ng/ml和2 ng/ml的一致性，一致性分析結(jié)果見表4(a)、(b)。

表4 (a)兩系統(tǒng)一致性結(jié)果統(tǒng)計表

陽性符合率:100.00%；95%CI:93.00%～100.00%；陰性符合率:100.00%；95%CI:77.19%～100.00%；總一致率為100.00%；95%CI:94.34%～100.00%。

表4 (b)兩系統(tǒng)一致性結(jié)果統(tǒng)計表

陽性符合率:100.00%；95%CI:86.21%～100.00%；陰性符合率:100.00%；95%CI:91.24%～100.00%；總一致率為100.00%；95%CI:94.34%～100.00%。

在cut-off值0.5 ng/ml處，理邦m16與對照系統(tǒng)的陰、陽性符合率均為為100%，Kappa值分別為1；在2 ng/ml處，理邦m16與對照系統(tǒng)的陰、陽性符合率均為100%，Kappa值分別為1。兩POCT系統(tǒng)在cutoff值0.5 ng/ml和5 ng/ml處均具有良好的一致性。

2.1 0 醫(yī)學(xué)決定處水平的偏倚分析

在醫(yī)學(xué)決定處水平0.5 ng/ml、2 ng/ml處，利用回歸方程計算試驗系統(tǒng)與對照系統(tǒng)的預(yù)期偏倚Bc=a+(b-1)Xc，相對偏差=Bc/Xc。在0.5 ng/ml處，理邦m16與羅氏e411結(jié)果之間預(yù)期偏倚Bc為0.01，Bc95%CI為[-0.109～0.127]，相對偏差為2%；在2 ng/ml處，預(yù)期偏倚Bc為-0.02，95%CI為[-0.091～0.129]，相對偏差為-1%，均符合血清PCT室間質(zhì)評中的±30%要求。

3 討論

PCT作為重要的全身炎癥反應(yīng)和細菌感染的指標(biāo)，特異性強、敏感性維持時間長，隨著感染的消除逐漸下降而非常適用于臨床[22]。PCT的使用為臨床醫(yī)生提供簡單、有效的鑒別感染類型的方法，避免延誤患者治療，同時在減少抗菌藥物用量、縮短抗感染療程方面也發(fā)揮重要作用。臨床檢驗PCT使用的分析設(shè)備應(yīng)具備實用性和可靠性，理邦m16磁敏免疫分析系統(tǒng)是基于巨磁阻芯片和主動微流控生物芯片的新一代POCT設(shè)備，具有準確度高、重復(fù)性好和高靈敏的特點，同時采用人性化POCT便攜式設(shè)計，操作簡單，適合在臨床多個科室使用。根據(jù)國際標(biāo)準化組織(International Organization for Standardization，ISO)15189“醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的專用要求”的規(guī)定，設(shè)備性能需滿足規(guī)定的標(biāo)準[23]。

本研究顯示，磁敏免疫法定量檢測3個濃度水平的PCT的測試結(jié)果的驗證區(qū)間包含理論值，準確度可靠。最低檢出限驗證結(jié)果顯示，實驗系統(tǒng)檢測PCT的檢出限LoD為0.008 ng/ml，低值樣本測定的所有25個結(jié)果中小于LoB的數(shù)目＜3個，LoD和LoB的設(shè)置合理；定量檢測限驗證結(jié)果顯示，當(dāng)樣本濃度為0.06 ng/ml時，檢測結(jié)果的偏差和精密度滿足要求。精密度評估結(jié)果顯示，在濃度水平為0.5 ng/ml和5 ng/ml時，PCT檢測批內(nèi)和批間精密度均＜10%，滿足臨床檢測的要求。線性范圍的評估結(jié)果顯示，在0.01～50 ng/ml范圍內(nèi)線性度良好。干擾試驗驗證結(jié)果表明:血紅蛋白濃度5000 mg/dl、膽紅素濃度15 mg/dl、甘油三脂濃度3000 mg/dl、類風(fēng)濕因子濃度200 IU/ml、噬異性抗體滴度1∶64、生物素濃度10 mg/dl、人抗鼠抗體濃度50 pg/ml時，檢測結(jié)果偏差＜15%，干擾物低于上述臨界值時不會對檢測結(jié)果產(chǎn)生顯著干擾。

方法學(xué)比對結(jié)果顯示，理邦m16系統(tǒng)檢測64例臨床血清樣本與市場反饋良好的羅氏e411及配套試劑盒檢測結(jié)果顯著相關(guān)(rp＞0.975)，線性回歸方程為Y=-0.006+0.993X(R2=0.997)；醫(yī)學(xué)決定水平0.5 ng/ml和2 ng/ml處的預(yù)期偏倚Bc分別為0.01 ng/ml和-0.02 ng/ml，相對偏倚小于衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)量評價中PCT規(guī)定的30%的標(biāo)準，滿足臨床要求。Bland-Altman差異分析顯示，兩系統(tǒng)相對偏差一致性界限LoA為[-29.9，23.9]，兩系統(tǒng)結(jié)果總體平均偏差-3.0%，100%點位于一致性范圍內(nèi)。一致性分析結(jié)果顯示，兩系統(tǒng)陰陽性符合率及總符合率較高，kappa值＞0.75，認為兩系統(tǒng)等效。以羅氏e411為參照，理邦m16檢測體系檢測PCT的臨床性能在相關(guān)性、準確度及一致性方面與參照系統(tǒng)相當(dāng)，具有很好的臨床應(yīng)用價值。

磁敏免疫法檢測PCT的方法學(xué)性能良好，符合有關(guān)文件的規(guī)定和要求，能為臨床快速提供準確、可靠的檢驗結(jié)果，滿足臨床需要。