林少華，羅紅霞 ，賈紅亮，句榮輝，王建，李星宇

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京 102442）

近年來(lái)，由于奶酒含有人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素，且具有驅(qū)寒活血、開胃消食及降低膽固醇等功效[1]，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。奶酒是以動(dòng)物乳、乳清或乳清粉等為主要原料，經(jīng)發(fā)酵等工藝釀制而成的飲料酒[2]。然而，奶酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展仍處于初級(jí)階段，受到很多因素的制約，尤其是發(fā)酵菌株的篩選等方面的研究起步較晚[3]，這在很大程度上影響著奶酒的工業(yè)化生產(chǎn)。目前，奶酒菌株的分離和篩選多采用傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法，如賀銀鳳等人[4]從內(nèi)蒙古錫盟不同地區(qū)采集的奶酒樣品中分離純化鑒定了球菌5個(gè)屬，桿菌6個(gè)屬，酵母菌6個(gè)屬。吳敬[5]在錫林郭勒盟收集的奶酒中分離出47株乳酸菌，分別歸類為乳桿菌（Lactobacillus）、糞腸球菌（Enterococcus ceails）、堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（Enterococcus durans）、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis）、假鳥腸球菌（Enterococcus pseudoarium）和腸膜明串珠菌葡聚糖亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranixum）。Mu等[6]從內(nèi)蒙古、新疆和青海采集到96份奶酒，獲得655株酵母菌，分屬12種酵母，分別是近鄒褶假絲酵母（Candida pararugosa）、異常德克拉酵母（Dekkera anomala）、地絲菌屬亞種（Geotrichum sp.）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、單孢釀酒酵母（Kazachstania unispora）、馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、畢赤酵母（Pichia deserticola）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、曼氏畢赤酵母（Pichiamanshurica）、膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens）、釀酒酵母（Saccharomyces erevisiae）和球擬酵母（Torulaspora delbrueckii）。

盡管可培養(yǎng)方法是微生物中最常見的研究方法，但這種方法得到的微生物信息比較有限，對(duì)微生物體系的認(rèn)識(shí)存在一定的局限性。最近發(fā)展起來(lái)的高通量測(cè)序技術(shù)為分析復(fù)雜的微生物體系提供了一種高效便捷的方法，能夠獲得微生物群落中的全部微生物的遺傳信息，因此，可用于奶酪、白酒、泡菜等發(fā)酵食品微生物體系的分析[7～10]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)奶酒中的真菌群落進(jìn)行研究，并結(jié)合傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法對(duì)真菌群落的曲霉屬進(jìn)行分離和鑒定，為奶酒的微生物分離與鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶酒，采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟牧區(qū)；三羥甲基氨基甲烷，美國(guó)Amresco公司；宏基因組DNA提取試劑盒25T/50T，北京福德安科技（北京）有限公司；10×PCR buffer、dNTP、rTaq DNA聚合酶、上樣緩沖液6×Loading Buffer，寶生物工程（大連）有限公司；引物，上海生工生物工程有限公司；2000bp marker，賽默飛世爾科技公司；真菌基因組DNA提取試劑盒D3390-02，OMEGA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQJ-254型紫外強(qiáng)度計(jì)，上海顧村電光儀器廠產(chǎn)品；短波紫外線保鮮照射箱，國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮中心（天津）產(chǎn)品；超低溫冰箱，Sanyo（MDF-382E）；超凈工作臺(tái)，北京王堂藍(lán)翼科技有限公司；小型離心機(jī)，Sigma（1-14）；低溫高速離心機(jī)，Eppendoff（Centrifuge 5804 R）；PCR擴(kuò)增儀，BioRad（ALD1244）；定量PCR儀，BioRad（CFX96）；凝膠成像儀，UVP（GelDoc-It Imagine System）；高通量測(cè)序儀，Illumina（Miseq）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高通量測(cè)序

（1）基因組DNA的提取：按照DNA提取試劑盒的說(shuō)明提取奶酒真菌總的DNA，然后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。

（2）PCR擴(kuò)增及測(cè)序：對(duì)真菌的ITS 1區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用1× TAE濃度為2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物，然后割膠并使用GeneJET 膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶。使用New England Biolabs公司的NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)，合格后，使用HiSeq進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

（3）數(shù)據(jù)處理：根據(jù)拆分出的樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（V1.2.7）對(duì)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始數(shù)據(jù)（Raw Data）；然后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)（Clean Data）。通過(guò)QIIME（V1.7.0）的質(zhì)量控制流程，得到Tags序列，與Gold database數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并去除其中的嵌合體序列，從而得到最終的有效數(shù)據(jù)。

（4）OTUs聚類：利用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）將樣品的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），同時(shí)選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選出OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1），獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

1.3.2 曲霉菌的分離純化

用平板稀釋法將奶酒樣品在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上于2℃培養(yǎng)3～7d，挑取形態(tài)與曲霉菌相似的菌落通過(guò)平板劃線進(jìn)行分離純化，通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察。確認(rèn)為曲霉菌的就接種到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，進(jìn)行分離純化2～3次。

1.3.3 菌株的16S鑒定

（1）細(xì)菌基因組DNA抽提：使用真菌基因組DNA提取試劑盒，按步驟操作，提取出細(xì)菌基因組DNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）引物序列：ITS 1，TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS 4，TCCTCCGCTTATTGATATGC。

（3）PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為10×Ex Taq buffer，5.0μL；2.5mM dNTP Mix，4.0μL；10p Primer 1，2.0μL；10p Primer 2，2.0μL；5u Ex Taq，0.5μL；Template，2.0μL；ddH2O，36.5μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性，94℃ 3min；變性，94℃ 30s；退火，60℃ 30s；延伸，72℃ 1min；從變性到延伸循環(huán)35次。

（4）切膠純化測(cè)序：紫外燈照射下觀察瓊脂糖凝膠，對(duì)含有目的基因DNA的比較亮的條帶進(jìn)行切割回收，純化，后用測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)分析

經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)前處理，奶酒樣品總的DNA經(jīng)測(cè)序分析得到47 147條有效序列數(shù)據(jù)，序列的長(zhǎng)度為200～466bp之間，平均長(zhǎng)度為409bp。從奶酒中真菌的稀釋曲線（圖1）可以看出，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，它們所能代表構(gòu)建的OTUs數(shù)量也增加，但是曲線的斜率先上升后變得平坦，說(shuō)明本測(cè)序的數(shù)據(jù)量是合理的，能夠反映樣品中微生物群落的種類和結(jié)構(gòu)。

圖1 奶酒樣品中真菌測(cè)序的稀釋曲線

2.2 屬分類水平上的菌群樣本組成分析

經(jīng)過(guò)分析比對(duì)已得的OTUs，共鑒定到3門11綱19目26科39屬。經(jīng)在屬的分類水平上進(jìn)行分析（圖2），真菌分布豐度占比前十位的屬分別為酵母菌屬（Saccharomyces）、曲霉屬（Aspergillus）、念珠菌屬（Candida）、根霉屬（Rhizopus）、干酪酵母菌屬（Meyerozyma）、鏈孢霉屬（Neurospora）、毛孢子菌屬（T r i c h o s p o r o n）、棒狀孢菌屬（Corynespora）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、鐮刀菌屬（Fusarium）。其中，酵母菌屬（Saccharomyces）的豐度約為62%，為第一豐度的屬。酵母菌屬是一種形狀呈細(xì)胞圓形、橢圓形或柱形的無(wú)性繁殖的單細(xì)胞生物重要真菌，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖等糖類產(chǎn)生酒精，在釀酒工業(yè)中有著重要應(yīng)用。豐度占比第二的為曲霉屬（Aspergillus），比例約為33%。曲霉屬中部分菌種可將淀粉質(zhì)原料轉(zhuǎn)化成葡萄糖，而且糖化力強(qiáng)，繁殖速度快，熱穩(wěn)定性良好，耐酸，耐酒精，不產(chǎn)或少產(chǎn)可降低甲醇生成量的果膠酶。由于它們具有酶系豐富，產(chǎn)酶活性高，生長(zhǎng)速度快，適應(yīng)能力強(qiáng)，易于管理等特點(diǎn)，是釀酒微生物的重要組成部分，因此，本文將對(duì)其進(jìn)行下一步的分離與鑒定。

圖2 基于屬分類水平上的奶酒樣品菌群分布圖

2.3 分離與鑒定

將經(jīng)過(guò)分離后的菌株進(jìn)行16S鑒定，得到樣本的拼接序列，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果為Aspergillus sp.，因此，本研究成功地分離出目標(biāo)菌株。

3 結(jié)論

奶酒營(yíng)養(yǎng)豐富，具有一定的保健功能。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，能夠從全貌上了解其微生物的群落結(jié)構(gòu)。本文通過(guò)測(cè)定奶酒的真菌生物多樣性得知，酵母菌屬（Saccharomyces）和曲霉屬（Aspergillus）是奶酒最主要的真菌群落，其中，酵母菌屬（Saccharomyces）為第一豐度的真菌，豐度約為62%。第二豐度的真菌為曲霉屬（Aspergillus），豐度為33%。根據(jù)試驗(yàn)需要，通過(guò)進(jìn)一步分離并采用16S鑒定出了曲霉菌，為下一步開發(fā)奶酒發(fā)酵劑提供了理論依據(jù)。