鄧友貴

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不同強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞膜ATP敏感性鉀通道亞基Kir6.1和Kir6.2基因表達(dá)的影響

鄧友貴

（東莞市南華職業(yè)技術(shù)學(xué)校， 廣東 東莞 523932）

建立大鼠不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)模型，以SD大鼠心肌細(xì)胞膜ATP敏感性鉀通道為觀察對(duì)象，從分子水平探究不同強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞膜sarcKATPC亞基Kir6.1和Kir6.2表達(dá)量的變化。通過(guò)探討發(fā)生這些變化的原因，為更好地指導(dǎo)體育運(yùn)動(dòng)實(shí)踐，進(jìn)一步探討心肌保護(hù)機(jī)制和揭示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練規(guī)律提供理論依據(jù)。

ATP敏感性鉀通道；耐力運(yùn)動(dòng)；基因表達(dá)

近年來(lái)，運(yùn)動(dòng)和健康的研究正在廣泛的開(kāi)展，隨著生命科學(xué)的發(fā)展，人類基因-基因組學(xué)，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)組學(xué)，成為當(dāng)前生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。隨著人類后基因組計(jì)劃的開(kāi)展，耐力運(yùn)動(dòng)與心肌基因表達(dá)的研究也在不斷開(kāi)展，將來(lái)必定在運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性SD大鼠60只,4-8周齡,體重在110-130g，將SD大鼠隨機(jī)分為4組，即安靜對(duì)照組（X組）、高強(qiáng)度組(C組)、中強(qiáng)度組(B組)、低強(qiáng)度組(A組)，安靜組12只，其它三組均為15只，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（20±2）℃，光照時(shí)間10小時(shí)，相對(duì)濕度為25%-35%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

運(yùn)動(dòng)模型參照Tanaka,etal.2003的方法制備，采用耐力運(yùn)動(dòng)制備運(yùn)動(dòng)性心肌損傷模型，運(yùn)動(dòng)方式為跑臺(tái)，通過(guò)跑速、跑臺(tái)坡度控制強(qiáng)度。訓(xùn)練結(jié)束后立即注射20%烏拉坦麻醉后，冰上解剖取材。訓(xùn)練安排：安靜對(duì)照組常規(guī)分籠飼養(yǎng)，不進(jìn)行耐力性運(yùn)動(dòng)，其余三組一周進(jìn)行六天耐力訓(xùn)練，訓(xùn)練后放回籠中休息，訓(xùn)練前后稱重。低強(qiáng)度組的訓(xùn)練在時(shí)間上與中、高強(qiáng)度組基本一致，但跑臺(tái)速度和坡度有區(qū)別，低強(qiáng)度組跑臺(tái)速度、坡度均不變，中、高強(qiáng)度組的訓(xùn)練隨時(shí)間的推移運(yùn)動(dòng)速度相應(yīng)地增加，訓(xùn)練8周后進(jìn)行動(dòng)物處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

2.1.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank登錄的基因mRNA序列，應(yīng)用primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其特異性，并獲取擴(kuò)增鼠內(nèi)參β—actin，設(shè)計(jì)的引物合成后，于-20℃條件下保存，引物序列如表1所示。

表1 引物序列

PrimersSequenceAAccession number Kir6.1F：5’-TGACTGAGGAGGAGGGAGTG-3’NM-017099.4 R：5’-CTCTTTTGGAGGGTCTGAATC-3’ Kir6.2F：5’-CAAGCCCAAGTTTAGCATCTCT-3’NM-031358.3 R：5’-GCACCCCAGCACTCTACATAC-3’ β-actinF：5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’AC-000080.1 R：5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA -3’

2.1.2 總RNA的提取

(1) 切取30-50mg組織，加入1000μl的 TotalRNA充分研磨，將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，加入200μl的氯仿，劇烈震蕩10sec，手動(dòng)混勻2min。(2) 將裂解后樣品或勻漿液室溫放置5-10min,使得核蛋白與核酸完全分離。(3) 按適當(dāng)比例加入氯仿，手動(dòng)劇烈振蕩管體15Sec后，手動(dòng)顛倒混勻2min，室溫放置3min。4℃下12000rPm離心10min。(4) 吸取上層水相轉(zhuǎn)移到新的干凈離心管中。水相與同等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后室溫放置20min。(5) 室溫放置20min后，于4℃12000rpm離心10min。(6) 加入lml75%乙醇清洗RNA沉淀，4℃12000rpm離心3min，移去上清液。室溫干燥5-10min。(7) 加入30-50μl RNase-free ddH2O,充分溶解RNA沉淀，55-60℃孵育10min。

2.1.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行操作，配制RT反應(yīng)液，并加到0.2ml的RT反應(yīng)管中。

表2 RT反應(yīng)體系

ComponentVolume(μl) Control GAPDH RNA(50ng/μl)2μl Oligo(dT)18 Primer1μl or Random Hexamer Primer or Reverse GAPDH Primer1μl 5×reaetion buffer4μl RiboLock RNase Inhibitor(20u/μl)1μl 10mM dNTP mix2μl RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200u/μL)1μl Water,nuclease-free9μl Total volume20μl

以上反應(yīng)液的總體積為20μl，將反應(yīng)液手動(dòng)混勻，離心一分鐘，在PCR擴(kuò)增儀上按以下條件進(jìn)行RT反應(yīng)：70℃5min，42℃60min，4℃30min。RT產(chǎn)物為第一鏈cDNA。

2.1.4 PCR擴(kuò)增Kir6.1，Kir6.2和β-actin：取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。

表3 PCR反應(yīng)體系

ComponentVolume(μl) cDNA2μl 10×PCR buffer5μl 10mM dNTP Mix1 μl 10mM上游引物1.5μl 10mM下游引物1.5μl 25mM MgCl23 μl Taq DNA polymerase(5u/μL)0.5μl Water,nuclease-free35.5μl Total volume50μl

將以上反應(yīng)液離心混勻再進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)條件如表4所示。

表4 PCR反應(yīng)條件

SteptemperatureTimeNumber of cycles Initial/denaturatian94℃3min1 Denaturatian94℃30S36 Annealing58℃30S36 Extension72℃60S36

72℃延伸5min，從第二步到第四步循環(huán)36次,目的基因Kir6.1和Kir6.2以及內(nèi)參β-actin的擴(kuò)增片段不同組別大小不一樣，具體見(jiàn)圖表數(shù)據(jù)分析。

2.1.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR結(jié)果

1h36min的PCR反應(yīng)后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl與6x Loading Buffer 2μl混勻加入點(diǎn)樣孔，凝膠電泳80min后取出凝膠放入成像分析儀中，成像觀察、拍照并處理數(shù)據(jù)。PCR的擴(kuò)增曲線基本擬合良好，電泳條帶比較模糊，但四組的基因表達(dá)未見(jiàn)顯著差異，說(shuō)明PCR反應(yīng)體系較穩(wěn)定，結(jié)果可靠。凝膠電泳分析，B組內(nèi)參的條帶比較清晰，但目的基因的表達(dá)條帶模糊，有重疊現(xiàn)象，Kir6.2的表達(dá)，部分條帶不在Maker范圍內(nèi)，如圖1、2所示。

圖1 B組Kir6.1表達(dá)

圖2 B組Kir6.2 表達(dá)

注：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR結(jié)果：低強(qiáng)度組（A），中強(qiáng)度組（B），高強(qiáng)度組（C），安靜對(duì)照組(X)，Market左邊的條帶為內(nèi)參，右邊數(shù)字代表基因條帶，DNA Marker （從上而下大小依次為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp）。

經(jīng)成像分析系統(tǒng)處理后，發(fā)現(xiàn)C組Kir6.1和Kir6.2表達(dá)量都很少，內(nèi)參基因的表達(dá)量很弱，圖像上的條帶模糊，能看見(jiàn)一絲白色的斑點(diǎn)，兩個(gè)目的基因的條帶都有重疊現(xiàn)象，X組的內(nèi)參基因表達(dá)條帶比C組更模糊，幾乎是不表達(dá)，如圖3-4所示。

圖3 C組Kir6.1表達(dá)

圖4 C組Kir6.2表達(dá)

2.1.6 RT-PCR檢測(cè)Kir6.1 和Kir6.2表達(dá)的結(jié)果分析

表5 各組心肌Kir6.1和Kir6.2的表達(dá)

GroupnKir6.1Kir6.2 低強(qiáng)度（A組）80.44±0.130.48±0.13 中強(qiáng)度（B組）80.48±0.020.64±0.41 Δ 高強(qiáng)度（C組）80.38±0.09 *0.50±0.01 安靜對(duì)照（X組）81.00±0.010.29±0.03

注：*表示與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異，Δ表示與安靜對(duì)照組相比具有顯著性差異（p<0.05）

Kir 6.1表達(dá)結(jié)果顯示：四個(gè)組的表達(dá)量都不高，但安靜對(duì)照組的表達(dá)水平與中底高強(qiáng)度耐力組相比要上調(diào)，不同強(qiáng)度組里表達(dá)量最高的是中強(qiáng)度組，高強(qiáng)度與中強(qiáng)度組的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異，強(qiáng)度與表達(dá)量成反比關(guān)系，安靜對(duì)照組與高強(qiáng)度相比具有顯著性差異（P<0.05），ABC三組表達(dá)水平下調(diào)，但三組之間表達(dá)無(wú)顯著性差異?？梢?jiàn)在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中可能Kir6.1mRNA降解，不同強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)能抑制Kir6.1的生成，中高強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)造成大鼠比較嚴(yán)重的心肌損傷，但強(qiáng)度不同表達(dá)水平區(qū)別也不大。

經(jīng)過(guò)2（-delta delta c(t)）方法計(jì)算后得出數(shù)據(jù)：X組Kir6.1表達(dá)量是A組的2.27倍；X組Kir6.1分別是B組、C組的2.08倍、2.63倍;B組Kir6.1是C組的1.26倍；A組Kir6.1是C組的0.12倍（如圖5-6所示）。

圖5-6 各組心肌細(xì)胞膜Kir6.l和Kir6.2表達(dá)相對(duì)比值

Kir6.2表達(dá)結(jié)果顯示：四個(gè)組的Kir6.2與Kir6.1的表達(dá)量相當(dāng)，從上述分析中得出Kir6.1的表達(dá)量最高的是安靜對(duì)照組，而Kir6.2的表達(dá)量則出現(xiàn)相反的趨勢(shì)，耐力運(yùn)動(dòng)組的表達(dá)水平都比安靜對(duì)照組高，其中B組較其它三組Kir6.2表達(dá)量都要高，三個(gè)耐力運(yùn)動(dòng)組之間的表達(dá)無(wú)顯著性差異；C組Kir6.2表達(dá)水平較A組和X組上調(diào)，無(wú)顯著性差異。中強(qiáng)度組較安靜對(duì)照組達(dá)標(biāo)水平上調(diào)具有顯著性差異（P<0.05）。

3 結(jié)論

3.1 Kir 6.1的表達(dá)：四個(gè)組的表達(dá)量都不高，但安靜對(duì)照組的表達(dá)水平與三個(gè)強(qiáng)度組相比要上調(diào)，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與表達(dá)量成反比關(guān)系，Kir 6.2的表達(dá)：耐力運(yùn)動(dòng)組的表達(dá)水平都比安靜對(duì)照組高，中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組表達(dá)量最高。

3.2 耐力運(yùn)動(dòng)能抑制大鼠心肌細(xì)胞膜KATP通道亞基Kir6.1的基因表達(dá)，但能提高Kir6.2的表達(dá)水平，可能說(shuō)明通過(guò)抑制Kir6.1的基因表達(dá)來(lái)參與心肌的保護(hù)作用。

[1]孫嘯, 陸祖宏, 謝建明.生物信息學(xué)基礎(chǔ).清華大學(xué)出版社，2005.

[2]薩姆布魯克 J, D.W.拉塞爾著.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南, 第三版. 北京: 科學(xué)出版社,2002:864-889.

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Effects of Endurance Exercise of Different Intensity on Expression of ATP-Sensitive Potassium Channel Subunit Kir6.1 and Kir6.2 Gene in Rat Myocardial Cell Membranes

DENG Yougui

(Nanhua Vocational and Technical School, Dongguan 523932, Guangdong, China)

鄧友貴（1986—），碩士，中學(xué)體育二級(jí)，研究方向：體能訓(xùn)練與恢復(fù)。