周 正,鄭 偉

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腫瘤科，沈陽(yáng) 110000)

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)、危害極大的惡性腫瘤，以原發(fā)性肝癌較為常見(jiàn)，其病因及確切分子機(jī)制尚不完全明確[1-2]。肝癌早期癥狀不明顯，多數(shù)一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即為晚期，研究肝癌發(fā)生、發(fā)展分子學(xué)機(jī)制對(duì)于肝癌的診治具有重要意義[3]。Src同源性2 b銜接蛋白1(Src homology 2 binding protein 1，SH2B1)是含有SH2和PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)接頭蛋白，在代謝平衡、免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，與多種惡性腫瘤的增殖、遷移過(guò)程有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，SH2B1在非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌等惡性腫瘤患者癌組織中高表達(dá)，但在肝癌中研究較少[4-6]。本研究重點(diǎn)探討肝癌細(xì)胞株HepG2中SH2B1表達(dá)水平異常情況及沉默SH2B1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡以及蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(protein kinase B/mammalian target of rapamycin,Akt/mTOR)通路的影響，為臨床治療肝癌提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人正常肝細(xì)胞株QSG-7701、肝癌細(xì)胞株HepG2均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；慢病毒載體系統(tǒng)、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Trizol、二喹啉甲酸提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640培養(yǎng)基購(gòu)自南通市百奧邁科生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting Kit-8，CCK-8)實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司；鼠源一抗[SH2B1、Bax、Bcl-2、caspase-3、p-Akt、Akt、mTOR、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)]、二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠)購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology。

1.2方法

1.2.1熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中SH2B1 mRNA表達(dá)情況 采用熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法測(cè)定正常肝細(xì)胞株QSG-7701、肝癌細(xì)胞株HepG2及重組轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中SH2B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)SH2B1序列設(shè)計(jì)mRNA引物，以GAPDH為內(nèi)參，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，SH2B1引物序列為5′-GCGCATCGTTACCATCATCACG-3′，3′-TTCTTCCTCTGTCCGACGGTCT-5′，GAPDH引物序列為5′-ATTGGAAC-GATACAGAGAAGATT-3′，3′-GGAACGCTTCACGAATTTG-5′。通過(guò)Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。配置實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)體系，完成后將其放入熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀上進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)定為：95 ℃預(yù)處理5 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，以上3個(gè)步驟共循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用2-ΔΔCt算法[7]計(jì)算SH2B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出裝有人正常肝細(xì)胞株QSG-7701、肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的凍存管，于37 ℃水浴鍋中快速解凍，待其完全解凍后置于離心管內(nèi)，離心半徑10 cm,1 000 r/min離心5 min，棄上清，加1 mL DMEM培養(yǎng)基懸垂細(xì)胞，吹打混勻，吸入無(wú)菌培養(yǎng)瓶，加入4 mL培養(yǎng)基混勻，置于溫度為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。按照實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行細(xì)胞傳代，取第3代進(jìn)行細(xì)胞接種。

1.2.3重組慢病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 針對(duì)SH2B1基因利用軟件設(shè)計(jì)合成兩條單鏈DNA Oligos，將兩條DNA oligos退火配對(duì)產(chǎn)生雙鏈，與慢病毒載體GV248連接，構(gòu)建重組慢病毒載體[SH2B1-短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)-綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-GV248作為SH2B1 shRNA組、NC-shRNA-GFP-GV248作為NC shRNA組]，同時(shí)以一段不針對(duì)任何基因的無(wú)關(guān)序列作為空白組，采用DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)培養(yǎng)293T細(xì)胞至細(xì)胞密度為70%，用Lipofectamine 2000將重組慢病毒載體與輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)6 h，更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后在4 ℃環(huán)境中放置15 min,以離心半徑10 cm，1 500 r/min 離心5 min，棄去細(xì)胞碎片，收集上清(包含病毒)，-80 ℃保存。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前1 d接種于12孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，按感染復(fù)數(shù)值感染細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)為50)，加入5 μg/mL的聚凝膠。24 h后更換為含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，此后每隔2天換液一次，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上時(shí)，加入嘌呤霉素進(jìn)行壓力篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.2.4免疫印跡法(Western blot法)檢測(cè)SH2B1蛋白及Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.2.3中各組細(xì)胞，加入RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay Lysis Buffer)裂解液，使用超聲波在室溫下勻漿，4 ℃離心半徑10 cm，10 000 r/min離心15 min，取上清液。使用BCA蛋白試劑盒測(cè)定細(xì)胞中總蛋白含量，制備電泳凝膠，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，0.01 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液洗膜(5 min×3次)，封閉。封閉完成后加入適宜濃度一抗(SH2B1，Bax、caspase-3、Bcl-2、p-AKT，AKT，mTOR，1∶1 000)，4 ℃封閉過(guò)夜，24 h后棄去一抗，清洗PVDF膜，加入相應(yīng)二抗(辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗鼠)，37 ℃封閉2 h，棄去二抗，清洗PVDF膜，滴加電化學(xué)發(fā)光顯色液，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)捕獲蛋白條帶圖，使用Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照并進(jìn)行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 各組培養(yǎng)0、24、48、72、96 h時(shí)吸光度值，按照1.2.3分組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH2B1細(xì)胞放入離心管內(nèi)，以離心半徑10 cm，1 000 r/min離心5 min棄上清，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，取10 μL細(xì)胞懸液，加入含1 mL RPMI 1640的微量離心管內(nèi)，吹打混勻，取10 μL稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1.0×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于12孔板，每孔100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，每孔加入10 μL濃度為1.5 mg/mL的CCK-8，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，讀取吸光度值(A)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，測(cè)定時(shí)以未接種細(xì)胞只加培養(yǎng)基孔的A值為空白對(duì)照調(diào)零。

1.2.6雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力 使用磷脂酰絲氨酸蛋白抗體/碘化丙啶(phosphatidylserine protein antibody/propidium iodide，Annexin V/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。3組細(xì)胞缺氧培養(yǎng)48 h，胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，離心棄上清液，配制成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL磷脂酰絲氨酸蛋白抗體-異硫氰酸熒光素(phosphatidylserine protein antibody/fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)和5 μL磷脂酰絲氨酸混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1肝癌細(xì)胞中SH2B1表達(dá)情況 與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞中SH2B1 mRNA、SH2B1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

2.2HepG2細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染后SH2B1表達(dá)變化 各組SH2B1 mRNA、SH2B1蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與空白組、NC shRNA組相比，SH2B1 shRNA組SH2B1 mRNA、SH2B1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

a:正常肝細(xì)胞；b:肝癌細(xì)胞圖1 兩組肝細(xì)胞中SH2B1蛋白表達(dá)情況表1 兩組肝細(xì)胞中SH2B1 mRNA、SH2B1蛋白相對(duì)表達(dá)情況比較

組別nSH2B1/GAPDHmRNA蛋白正常肝細(xì)胞31.10±0.210.35±0.06肝癌細(xì)胞 31.59±0.411.04±0.19t值2.6068.483P值0.026<0.001

SH2B1：Src同源性2b銜接蛋白1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

a：空白組；b：NC shRNA組；c：SH2B1 shRNA組圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞SH2B1蛋白表達(dá)情況

2.3沉默SH2B1表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 各組轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h、96 h后OD值呈下降趨勢(shì)

組別nSH2B1/GAPDHmRNA蛋白空白組31.06±0.211.03±0.18NC shRNA組31.04±0.191.02±0.17SH2B1 shRNA組30.57±0.09ab0.64±0.10abF值15.67612.481P值<0.0010.001

NC：陰性對(duì)照組；shRNA：短發(fā)夾RNA；SH2B1：Src同源性2b銜接蛋白1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；a與空白組比較，P<0.05；b與NC shRNA組比較，P<0.05

(P<0.05)；與空白組相比，NC shRNA組各時(shí)間點(diǎn)OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NC shRNA組和空白組相比，SH2B1 shRNA組轉(zhuǎn)染48 h、72 h、96 h后OD值顯著降低(P<0.05)；各組在組間、時(shí)點(diǎn)間、組間和時(shí)點(diǎn)間交互作用比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

組別nOD值(450 nm)0 h24 h48 h72 h96 h空白組30.13±0.030.33±0.061.05±0.211.54±0.301.73±0.28NC shRNA組30.16±0.030.35±0.071.16±0.231.59±0.311.81±0.29SH2B1 shRNA組30.15±0.030.34±0.070.64±0.03ab0.96±0.14ab1.16±0.04ab 組間F=6.357 P=0.015 時(shí)點(diǎn)間F=5.023 P=0.026 組間·時(shí)點(diǎn)間F=4.126 P=0.034

NC：陰性對(duì)照組；shRNA：短發(fā)夾RNA；SH2B1：Src同源性2b銜接蛋白1；a與空白組比較，P<0.05；b與NC shRNA組比較，P<0.05

2.4沉默SH2B1表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 空白組、NC shRNA組、SH2B1 shRNA組凋亡率分別為(13.21±2.13)%、(17.62±2.18)%和(30.62±4.16)%，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.725,P<0.001)，空白組與NC shRNA組細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與空白組、NC shRNA組相比，SH2B1 shRNA組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

2.5沉默SH2B1表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 各組Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白組與NC shRNA組Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與空白組、NC shRNA組相比，SH2B1 shRNA組細(xì)胞中Bax、caspase-3蛋白水平顯著上升(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平下降(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表4。

a：空白組；b：NC shRNA組；c：SH2B1 shRNA組圖3 免疫印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)表4 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

組別nBax/GAPDHBcl-2/GAPDHcaspase-3/GAPDH空白組30.32±0.060.54±0.110.33±0.07NC shRNA組30.34±0.070.51±0.100.32±0.06SH2B1 shRNA組30.73±0.15ab0.34±0.02ab0.85±0.17abF值15.51310.92022.115P值0.0040.010<0.01

NC：陰性對(duì)照組；shRNA：短發(fā)夾RNA；SH2B1：Src同源性2b銜接蛋白1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；a與空白組比較，P<0.05；b與NC shRNA組比較，P<0.05

2.6沉默SH2B1表達(dá)對(duì)Akt/mTOR通路的影響 各組p-Akt、mTOR蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白組與NC shRNA組比較p-Akt、mTOR蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與空白組和NC shRNA組比較，SH2B1 shRNA組p-AKT、mTOR蛋白水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表5。

a:空白組；b:NC shRNA組；c:SH2B1 shRNA組圖4 Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況表5 各組Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

組別np-Akt/AktmTOR/GAPDH空白組31.33±0.330.87±0.21NC shRNA組31.31±0.320.86±0.21SH2B1 shRNA組30.64±0.15ab0.29±0.06abF值5.93710.807P值0.0380.010

NC：陰性對(duì)照組；shRNA：短發(fā)夾RNA；SH2B1：Src同源性2b銜接蛋白1；Akt：蛋白激酶B；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；a與空白組比較，P<0.05；b與NC shRNA組比較，P<0.05

3 討 論

SH2B1屬于SH2B家族，包含SH2和PH區(qū)域，在生長(zhǎng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、代謝平衡中發(fā)揮重要作用[6]。SH2B1過(guò)往研究多集中在脂肪調(diào)控、血糖控制等代謝類疾病方面[7-8]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)SH2B1在胃癌、肺癌等惡性腫瘤中存在異常表達(dá)[9-10]。Liu等[9]研究表明，SH2B1在胃癌中高表達(dá)，且參與胃癌增殖、侵襲、遷移過(guò)程。Zhang等[10]研究表明，SH2B1在非小細(xì)胞肺癌組織及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中高表達(dá)。本研究中，SH2B1在肝癌細(xì)胞株HepG2中表達(dá)顯著高于人正常肝細(xì)胞株，推測(cè)SH2B1高表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。借助慢病毒載體轉(zhuǎn)染SH2B1后，HepG2細(xì)胞中SH2B1 mRNA、SH2B1蛋白表達(dá)量顯著降低，提示本研究轉(zhuǎn)染效率較高。

癌細(xì)胞增殖能力強(qiáng)是癌癥發(fā)展迅速的原因之一[11]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SH2B1 shRNA 24 h，HepG2細(xì)胞增殖緩慢，且3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，48 h后SH2B1 shRNA組OD值顯著低于空白組及NC shRNA組，提示沉默SH2B1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖有一定抑制作用。研究表明，下調(diào)胃癌細(xì)胞中SH2B1表達(dá)后，胃癌細(xì)胞凋亡率顯著升高[12]。本研究中流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，沉默SH2B1表達(dá)后細(xì)胞凋亡率顯著升高，與在胃癌中表達(dá)一致，此外促凋亡相關(guān)蛋白Bax、凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3表達(dá)增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降，提示沉默SH2B1表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和HepG2細(xì)胞凋亡，控制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度。

Akt/mTOR信號(hào)通路參與控制細(xì)胞自噬、運(yùn)動(dòng)、增殖、生長(zhǎng)及存活等多種細(xì)胞過(guò)程，其激活異常與人類多種疾病有關(guān)，大量研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12-14]。研究表明Akt/mTOR信號(hào)通路在肝癌中存在異常激活，阻斷Akt/mTOR信號(hào)通路是治療肝癌的新思路[15-17]。Akt是細(xì)胞存活的主要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)直接抑制促凋亡蛋白或抑制由轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生促凋亡信號(hào)參與調(diào)解細(xì)胞存活[18]。mTOR底物磷酸化可增強(qiáng)合成代謝或限制分解代謝，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。本研究中，沉默SH2B1表達(dá)后，Akt磷酸化、mTOR蛋白水平顯著降低，提示沉默SH2B1表達(dá)可能抑制Akt磷酸化、mTOR蛋白表達(dá)，推測(cè)一方面Akt磷酸化降低可直接促進(jìn)促凋亡蛋白Bax、caspase-3表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，另一方面Akt磷酸化引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制mTOR蛋白表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，SH2B1在肝癌中高表達(dá)，沉默SH2B1表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制Akt/mTOR信號(hào)通路活性發(fā)揮作用的。提示SH2B1可能作為治療肝癌的靶點(diǎn)，具有一定的應(yīng)用前景。但本研究也存在不足，SH2B1通過(guò)Akt/mTOR信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步探究。