李 剛 喻紅彪 任思宏

(南充市中心醫(yī)院麻醉科，南充 637000)

高濃度的氧對嚴重的呼吸衰竭有良好的治療作用，一般在重癥監(jiān)護室應(yīng)用較多[1]。但是長時間地吸入高濃度的氧氣卻會造成肺損傷[2]。高氧造成的肺損傷的原因主要是線粒體產(chǎn)生的活性氧，活性氧可活化炎癥細胞，以及釋放炎性介質(zhì)，引起肺組織結(jié)構(gòu)的重建與上皮細胞死亡，是急性肺損傷的原因[3]。右美托咪定是一種高選擇性的腎上腺素受體激動劑[1-2]，近年來在臨床上的使用已經(jīng)越來越廣泛。右美托咪定對血流動力學(xué)影響輕微[3]，已被廣泛應(yīng)用于外科手術(shù)。右美托咪定可以通過抑制凋亡和抗炎作用從而保護機體的大腦，肝臟，腸胃，心臟以及肺部組織[4]。炎癥小體是調(diào)節(jié)先天性免疫的多蛋白復(fù)合物[4]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在大量與腦損傷有關(guān)的炎癥小體[5]。目前國內(nèi)外在眾多的炎癥小體的研究中，NLRP3是研究的熱點[6]。炎癥小體和肺損傷機制關(guān)聯(lián)研究則相對較少。本研究探究右美托咪定對炎癥小體NLPR3抑制作用以及肺損傷的恢復(fù)機制，為右美托咪定預(yù)防及治療肺損傷方面提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量為(285.67±8.3)g，購自中科院上海實驗動物中心(實驗動物合格證：SCXK滬2002-0010)；鹽酸右美托咪定購自江蘇恩華藥業(yè)(批號：20131768)；兔源抗β-actin單克隆抗體來自碧云天公司；兔抗鼠Cav-1和NLRP3抗體均來自美國CST公司；基因的相關(guān)引物設(shè)計來自天津賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組及造模：將大鼠編號，隨機分為空白對照、模型組及右美托咪定組，各組10只。各組大鼠新環(huán)境適應(yīng)期3 d，空白對照組呼吸正常室內(nèi)空氣，模型高氧組大鼠放置于密閉氧氣環(huán)境內(nèi)，艙內(nèi)連接有輸氧管和測氧儀，實驗組高氧濃度為100%，高氧呼吸時間為1周，期間不斷檢測氧氣濃度。右美托咪定組大鼠在高氧艙內(nèi)期間，尾靜脈單次注射右美托咪定溶液，劑量為0.6 μg/kg體質(zhì)量，注射時間30 s。各組大鼠攝食飲水正常，飼養(yǎng)溫度23～25 ℃。

1.2.2生化指標檢測

1.2.2.1 大鼠呼吸頻率檢測:應(yīng)用成都儀器廠生產(chǎn)的DHX-150動物呼吸機來監(jiān)測大鼠呼吸頻率，將各組SD大鼠麻醉以后，套上呼吸機，潮氣量：4 mL/100 g，呼吸比：1∶1參數(shù)下檢測大鼠呼吸次數(shù)，記錄對比。

1.2.2.2 大鼠血清中IL-6、iNOS等含量檢測:完成呼吸頻率監(jiān)測后1 h取大鼠尾靜脈外周血5 mL。應(yīng)用酶聯(lián)免疫ELISA法監(jiān)測血清中的可溶性IL-6、iNOS等含量，將抗凝劑加入到提前準備好的潔凈試管中以后，于1 000 r/min離心，20 min，4℃條件下收取血清，在超低溫下冷凍保存。解凍以后使用試劑盒測定其濃度。繪制標準曲線，測定值代入標準曲線，計算各組的血清中IL-6、iNOS濃度。

1.2.2.3 大鼠肺組織干濕重比例測定:SD大鼠在高氧倉飼養(yǎng)1周后，麻醉處死大鼠，取其肺部組織，精準稱量右肺組織濕重，稱量之后立即放入到100 ℃的烘箱中，鼓風(fēng)干燥48 h后稱量質(zhì)量，所稱得為組織干重。肺組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.2.4 大鼠基因引物設(shè)計:IL-2，TNFα以及β-actin引物設(shè)計見表1。

表1 RT-PCR過程中引物序列(n=16)Table 1 Primer sequences in RT-PCR (n=16)

1.2.2.5 RT-PCR法測定SD大鼠血清中VEGF和bFGF表達量:使用軟件設(shè)計小鼠β-actin，TNF-α和IL-2上下游引物序列，選取長度小于150 bp的片段。RNA的提?。簩⒏鹘M60 mg的肺部組織置入離心管以后，加入Trizol試劑，研磨后離心取上清，后加入氯仿繼續(xù)離心取上清，加入異丙醇，吸取上清取沉淀，后用DEPC水溶解，于PCR擴增儀中擴增。上樣：將50×的TAE 稀釋為1× TAE 溶液作為溶劑，稱取0.52 g 瓊脂糖，加入到1×TAE溶液當(dāng)中，之后微波爐加熱煮沸，后加入 4 μL的核酸染料，搖晃混勻。最后將瓊脂糖凝膠水平放入電泳槽，依次加入 6 μL的 DNA Marker 以及目的基因 PCR 擴增產(chǎn)物。

1.2.2.6 Western Blot法測定大鼠IL-2、TNFα、NLPR3和Cav-1蛋白含量:取各組大鼠左肺組織60 mg，剪碎后置到離心管中，加RIPA裂解液和PMSF研磨1 min，后離心15 min取上清。用考馬斯法檢測各管吸光值，將各組蛋白調(diào)至同樣濃度后進行蛋白上樣。把NC膜放入到平皿后在容器中添加脫脂奶粉并在搖床上暗處封閉0.5～1.5 h。棄去奶粉后取出NC膜置于TBST中沖洗3次以后加入兔抗鼠Cav-1,β-actin和NLRP3抗體，4 ℃下孵育過夜。第2天取出NC膜，于TBST溶液中洗滌4次后加入2抗孵育，發(fā)光液a液和b液按1∶1 的比例現(xiàn)用現(xiàn)配，由左至右緩慢滴加到膜上，轉(zhuǎn)移到暗室進行膠片沖洗。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織干濕重比和呼吸頻率

造模前，各組大鼠呼吸頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后，與對照組比較，模型組和右美托咪定組大鼠呼吸頻率顯著降低；與模型組比較，右美托咪定組大鼠呼吸頻率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組肺組織干濕重比例顯著升高；與模型組比較，右美托咪定組肺組織干濕重比例顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.2 血清VEGF和bFGF含量結(jié)果比較

在造模1周后，與對照組比較，模型組和右美托咪定組血清中VEGF和bFGF水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，右美托咪定組血清中VEGF和bFGF水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表2 各組大鼠肺組織干濕重和呼吸頻率結(jié)果Table 2 Results of dry and wet weight and respiratory rate of lung tissue in each

注：與對照組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，#P<0.05

Note: compared with the control group,*P<0.05; compared with the model group,#P<0.05

表3 各組大鼠血清中VEGF和bFGF含量比較(n=16)Table 3 Comparison of serum VEGF and bFGF levelsin each group of rats (n=16)

注：與對照組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，#P<0.05

Note: compared with the control group,*P<0.05;compared with the model group,#P<0.05

2.3 血清IL-6和iNOS蛋白含量比較

在造模1周以后，與對照組比較，模型組和右美托咪定組IL-6和iNOS水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，右美托咪定組IL-6和iNOS水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠血清中IL-6和iNOS含量比較(n=16)Table 4 Comparison of serum IL-6 and iNOS (n=16)

注：與對照組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，#P<0.05

Note: compared with the control group,*P<0.05; compared with the model group,#P<0.05

2.4 IL-2和TNFα表達情況

RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組IL-2和TNFα的表達量顯著升高(P<0.05)。右美托咪定組的IL-2和TNFα表達量與模型組相比降低，與對照組相比略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5，圖1。

表5 各組大鼠IL-2和TNFα表達量比較(n=16)Table 5 Comparison of IL-2 and TNFα expression(n=16)

注：與對照組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，#P<0.05

Note: compared with the control group,*P<0.05;compared with the model group,#P<0.05

圖1 RT-PCR 檢測IL-2和TNFα表達情況Fig.1 RT-PCR detection of IL-2 and TNFα expression

2.5 NLPR3和Cav-1蛋白表達情況

蛋白質(zhì)免疫印記檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組和右美托咪定組的NLPR3和Cav-1蛋白表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，右美托咪定組NLPR3和Cav-1蛋白表達量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6，圖2。

表6 各組大鼠NLPR3和Cav-1蛋白表達量比較(n=16)Table 6 Comparison of NLPR3 and Cav-1protein expression (n=16)

注：與對照組相比較，*P<0.05；與模型組相比較，#P<0.05

Note: compared with the control group,*P<0.05;compared with the model group,#P<0.05

圖2 Western Blot 檢測NLPR3和Cav-1蛋白表達情況Fig.2 Western Blot detection of NLPR3 andCav-1 protein expression

3 討論

急性肺損傷指的是直接或者間接因素引起的肺泡及毛細血管細胞的損傷[7-8]，導(dǎo)致肺部間質(zhì)水腫以及急性呼吸功能不全，呼吸窘迫。由高氧引起的急性肺損傷案例目前已有很多報道[9]，一方面氧氣量的保障對不能自主呼吸的病人十分重要，另一方面長時間的吸入高純度的氧又會造成肺損傷，所以尋求合適的方式治療或預(yù)防由高氧引起的急性肺損傷十分重要。

VEGF和bFGF 在血管生成作用中占有重要的位置，可改善組織的缺氧狀態(tài)，研究表明血清中VEGF和bFGF的含量與肺損傷嚴重程度相關(guān)[10-11]。本研究顯示，大鼠在高氧倉飼養(yǎng)1周造模以后，模型組和右美托咪定組血清中VEGF和bFGF含量整體變低。右美托咪定組SD大鼠VEGF和bFGF含量與正常相比略有變化，與模型組相比恢復(fù)明顯。此外，SD大鼠在實驗期間肺組織的干濕重比例結(jié)果顯示，模型組的肺組織干濕重比明顯高于空白對照組和右美托咪定組，呼吸也變緩慢甚至衰竭，當(dāng)給藥以后各項指標均大幅恢復(fù)接近空白對照組，此結(jié)果初步探討了右美托咪定對肺損傷的恢復(fù)作用。綜合以往研究結(jié)果顯示[3,6]，右美托咪定對大鼠呼吸頻率及其它指標恢復(fù)更顯著，但其作用機制尚不明確。

白介素的表達量會直接引起炎癥反應(yīng)[12-13]。本實驗結(jié)果顯示，在構(gòu)建高氧模型以后，血清中的IL-6和IL-2表達量升高，高于空白對照組，經(jīng)過右美托咪定干預(yù)后，IL-2和IL-6表達量降低，接近正常水平，結(jié)果顯示，右美托咪定可以降低肺損傷，減少白介素的過度表達。TNF-a是腫瘤壞死因子，腫瘤壞死因子是炎癥反應(yīng)過程中直接相關(guān)的炎癥因子[14]。報道顯示，TNF-α的表達量升高直接反應(yīng)機體炎癥程度。本實驗結(jié)果顯示，在構(gòu)建高氧模型以后，模型組的TNF-α的表達量明顯高于空白對照組，但是經(jīng)過右美托咪定干預(yù)后，TNF-α表達量降低，肺損傷程度也對應(yīng)降低，提示右美托咪定對急性肺損傷的治療可能與炎癥因子調(diào)控相關(guān)。

NLRP3是細胞凋亡的重要蛋白[15-16]，本研究發(fā)現(xiàn)，建模以后，NLRP3的蛋白表達量明顯升高，注射右美托咪定之后，NLRP3蛋白表達量降低，此結(jié)果驗證右美托咪定阻遏高氧引起的急性肺部損傷有NLRP3的參與。Cav-1是重要的結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)蛋白，會參與到各組通路信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)中，調(diào)節(jié)細胞的跨膜和轉(zhuǎn)運，研究表明，Cav-1所在通路的激活會調(diào)控炎癥因子的表達，使肺損傷加重[17]。本實驗結(jié)果顯示，模型組Cav-1的蛋白表達量與空白對照組相比呈升高趨勢，進一步提示右美托咪定可以通過降低Cav-1蛋白表達量來緩解急性肺損傷。本研究顯示，右美托咪定可降低由高氧引起的肺損傷導(dǎo)致的呼吸頻率降低，肺組織干濕重比例變大。此外，右美托咪定還可以降低血清中的白介素IL-6，iNOS，VEGF和bFGF的表達，同時下調(diào)IL-2和TNF-α等促炎因子的表達水平。蛋白表達檢測結(jié)果顯示，右美托咪定可降低NLRP3和Cav-1蛋白的表達量，因此我們認為右美托咪定治療急性肺損傷可以通過下調(diào)NLRP3炎癥小體，激活Cav-1所在通路，進而實現(xiàn)肺高氧損傷保護。既往相關(guān)機制研究主要集中于TLR通路調(diào)控，本研究為右美托咪定肺部保護機制提供了新的方向。

綜上，右美托咪定可通過抑制NLRP3的異常表達，減少下游關(guān)鍵蛋白Cav-1等的表達，抑制重要的炎癥相關(guān)因子IL-2，IL-6，TNF-a等炎癥因子的表達，緩解急性肺損傷。