邢 進(jìn) 馮育芳 王 洪 岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 102629)

能力驗(yàn)證(Proficiency Testing)是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力。作為重要的外部質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，尋求并參加能力驗(yàn)證是合格評(píng)定機(jī)構(gòu)的責(zé)任和義務(wù)。合格評(píng)定機(jī)構(gòu)應(yīng)結(jié)合自身需求參加能力驗(yàn)證以證明其技術(shù)能力[1]。中國(guó)食品藥品檢定研究院(以下簡(jiǎn)稱(chēng)中檢院)作為CNAS能力驗(yàn)證提供者(Proficiency Testing Provider，PTP)已在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域開(kāi)展了包括病毒[2-4]、細(xì)菌[5-7]和遺傳[8-9]在內(nèi)的多項(xiàng)能力驗(yàn)證活動(dòng)。我們通過(guò)此前的能力驗(yàn)證活動(dòng)積累了一些經(jīng)驗(yàn)，得到了全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)的支持。2017年，中檢院依據(jù)CNAS-RL02《能力驗(yàn)證規(guī)則》和CNAS-RL03《能力驗(yàn)證提供者認(rèn)可準(zhǔn)則》(ISO/IEC 17043∶2010)[10]運(yùn)作NIFDC-PT-107“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸道樣品中支氣管鮑特桿菌檢測(cè)”的能力驗(yàn)證工作。支氣管鮑特桿菌是感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一種重要的呼吸道病原菌[11]，大鼠、豚鼠和兔等易感，引起支氣管肺炎癥狀[12],在實(shí)驗(yàn)用豬中是引發(fā)豬萎縮性鼻炎的主要病原之一[13]。通過(guò)對(duì)支氣管鮑特桿菌的檢測(cè)能力驗(yàn)證，初步評(píng)價(jià)參與實(shí)驗(yàn)室對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸道細(xì)菌的檢測(cè)能力?，F(xiàn)將本次驗(yàn)證的總體情況報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌種

支氣管鮑特桿菌(Bordetellabronchiseptica)ATCC 19395，產(chǎn)氣巴斯德桿菌(Pasteurellaaerogenes)ATCC 27883，大腸桿菌(Escherichiacoli)CMCC 44110分別購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心(CMCC)，三株標(biāo)準(zhǔn)菌株用作本次能力驗(yàn)證菌株，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

血瓊脂培養(yǎng)基(Oxiod)，DHL瓊脂(北京三藥科技開(kāi)發(fā)有限公司)，葡萄糖、蔗糖、三糖鐵、靛基質(zhì)、尿素、半固體等生化鑒定培養(yǎng)基(北京三藥科技開(kāi)發(fā)有限公司)，API 20E生化鑒定條(梅里埃)，革蘭陰性細(xì)菌鑒定板(BD、Vitek)，無(wú)菌脫纖維羊血(北京路橋技術(shù)股份有限公司)。

細(xì)菌保護(hù)液基礎(chǔ)液(本院食品化妝品檢定所提供)加入10%無(wú)菌脫纖維羊血制成此次比對(duì)樣品保護(hù)液。

DNA提取試劑盒(Qiagen)，DNA聚合酶(TAKARA)，瓊脂糖(TAKARA)。革蘭氏染色液(梅里埃)；兔抗支氣管鮑特桿菌免疫血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 主要儀器

生物安全柜(Thermo Scientific A2)、恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Heratherm)、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(BD Phoenix-100、梅里埃VITEK 2 Compact)、冷凍離心機(jī)(Hettich)、凍干機(jī)(Labconco)。

1.4 菌株的培養(yǎng)與鑒定

三株驗(yàn)證用菌種分別劃線接種于血瓊脂平皿(5%脫纖維羊血)復(fù)蘇，至36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取初代培養(yǎng)物中單個(gè)菌落再分別轉(zhuǎn)種于血瓊脂平皿，相同條件培養(yǎng)后備用。

根據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)[14]和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15]對(duì)三株驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行生化鑒定。

同時(shí)提取三種菌株的基因組DNA，擴(kuò)增其16S rDNA[16]，經(jīng)測(cè)序后與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，驗(yàn)證菌株的準(zhǔn)確性。

1.5 樣品制備

將支氣管鮑特桿菌、產(chǎn)氣巴斯德桿菌和大腸桿菌分別用無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，與保護(hù)液按1∶10比例均勻混合，制成1份陽(yáng)性和2份陰性樣品。樣品中菌含量約為107CFU/mL。三種樣品分裝于螺口1.5 mL無(wú)菌凍存管中，冷凍干燥，最終每管內(nèi)固體含量約為50～120 mg/管。三種能力驗(yàn)證樣品通過(guò)“國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證平臺(tái)”(http://nlyz.cnca.cn/lab/index.jsp)隨機(jī)分組編號(hào)，每組3管樣品，包含1管陽(yáng)性和2管陰性樣品，即包括支氣管鮑特桿菌(陽(yáng)性)、產(chǎn)氣巴斯德桿菌(干擾陰性)和大腸桿菌各1管。實(shí)驗(yàn)室無(wú)法通過(guò)樣品編號(hào)識(shí)別組別，可防止實(shí)驗(yàn)室間對(duì)結(jié)果的相互自行比對(duì)。

1.6 樣品檢驗(yàn)

1.6.1均勻性檢驗(yàn)：在已制備的三種樣品中分別隨機(jī)抽取10管樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，每管樣品重復(fù)測(cè)試2次。參照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，在樣品管中加入500 μL滅菌水，充分混勻。取10 μL樣品懸液用滅菌生理鹽水10倍梯度稀釋至10-6，取稀釋至10-5和10-6的樣品液各100 μL均勻涂布于血瓊脂平皿。36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并計(jì)算菌落數(shù)。

1.6.2穩(wěn)定性檢驗(yàn)：設(shè)置五個(gè)溫度條件(37 ℃、23 ℃室溫、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃)，每種溫度放置20組樣品，檢測(cè)樣品在各溫度下的穩(wěn)定性。37 ℃和23 ℃室溫中樣品每天取樣，4 ℃中樣品每3天取樣，-20 ℃中樣品每周取樣，-80 ℃中樣品每月取樣。參照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，將樣品管中加入500 μL無(wú)菌水，用10 μL接種環(huán)接種一滿(mǎn)環(huán)菌液涂布于血瓊脂和DHL瓊脂上，36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有足量的可見(jiàn)典型菌落生長(zhǎng)。

1.6.3樣品中雜菌的鑒定：制備樣品所用組分未經(jīng)過(guò)滅菌處理，除比對(duì)用標(biāo)準(zhǔn)菌株外，其中可能含有其他環(huán)境中的細(xì)菌。將空白細(xì)菌保護(hù)液接種于血瓊脂平皿，36 ℃培養(yǎng)24 h，對(duì)生長(zhǎng)出的雜菌進(jìn)行鑒定。

1.7 樣品的包裝和運(yùn)輸

1.5 mL螺口樣品管外層用封口袋包裝，置于適宜大小的干冰泡沫箱中，冷鏈快遞至參加實(shí)驗(yàn)室。

1.8 參加實(shí)驗(yàn)室

全國(guó)共25家實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加本次能力驗(yàn)證計(jì)劃，均如期反饋結(jié)果。其中各級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)16家，省級(jí)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室1家，藥檢系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室1家，科研院校實(shí)驗(yàn)室6家，企業(yè)實(shí)驗(yàn)室1家。實(shí)驗(yàn)室所在地區(qū)分布見(jiàn)表1。

表1 參加實(shí)驗(yàn)室所在地區(qū)分布Table 1 Region of participating laboratories

1.9 檢測(cè)方法和報(bào)告

本次能力驗(yàn)證未規(guī)定測(cè)試方法，可參考標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法[13,15]。要求在收到樣品后10個(gè)工作日內(nèi)反饋結(jié)果，并在規(guī)定期限內(nèi)提交完整的檢測(cè)報(bào)告。

1.10 結(jié)果評(píng)價(jià)原則

本次計(jì)劃中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到3份樣本，3份樣本的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果完全一致時(shí)，即判定為滿(mǎn)意結(jié)果；任何1份樣品的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致時(shí)，即判定為不滿(mǎn)意結(jié)果；實(shí)驗(yàn)室如未按時(shí)限反饋結(jié)果，亦判定為不滿(mǎn)意結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

三株驗(yàn)證用菌株的菌落和菌體形態(tài)均符合各自特征。支氣管鮑特桿菌在血瓊脂上形成1 mm左右、灰白色、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)可見(jiàn)輕微α溶血的菌落；革蘭氏陰性短桿菌；在DHL培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，形成約2 mm無(wú)色半透明菌落。大腸桿菌在血瓊脂上形成1～1.5 mm左右，灰白色略扁的菌落，不溶血；革蘭氏陰性小桿菌，兩端鈍圓濃染；在DHL培養(yǎng)基上形成粉紅色中等大小菌落。產(chǎn)氣巴斯德桿菌在血瓊脂上形成1.5 mm左右，灰白色圓潤(rùn)的菌落，不溶血；革蘭氏染色陰性小桿菌，兩極鈍圓濃染；在DHL培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，形成粉紅色中等菌落。

采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的鑒定方法、API 20E、BD和Vitek細(xì)菌鑒定儀的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、一致。血清凝集實(shí)驗(yàn)僅支氣管鮑特桿菌與診斷血清發(fā)生凝集。16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果與設(shè)定菌株相符。鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三種菌株鑒定結(jié)果Table 2 Identification result of three tested strains

注：A產(chǎn)酸(黃色)，K產(chǎn)堿(紅色)；W弱反應(yīng)

Note： A: acid (yellow); K: alkaline (red); W: weak reaction

2.2 均勻性

三種樣品在血瓊脂平皿上的菌落數(shù)均達(dá)到1×107以上的預(yù)期指標(biāo)，滿(mǎn)足均勻性要求。見(jiàn)表3。

表3 三種樣品均勻性驗(yàn)證結(jié)果Table 3 The homogeneity verification resultsof three kinds of samples

2.3 穩(wěn)定性

三種樣品在不同存放溫度下定期取樣，所制備樣品在37 ℃條件下可穩(wěn)定存放20 d，23 ℃室溫下可穩(wěn)定存放40 d，4℃下至少可穩(wěn)定存放60 d，-20 ℃下至少可穩(wěn)定存放180 d，-80 ℃條件下至少可穩(wěn)定存放240 d。

2.4 雜菌鑒定

空白細(xì)菌保護(hù)液經(jīng)培養(yǎng)后，在血瓊脂上可見(jiàn)有兩種雜菌生長(zhǎng)，一種為1 mm左右白色菌落，不易乳化；革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，呈梭形。另一種為1 mm左右黃色菌落，革蘭氏陽(yáng)性雙球菌。經(jīng)BD細(xì)菌鑒定儀鑒定，分別為格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)和變異庫(kù)克菌(Kocuriavarians)。

2.5 結(jié)果反饋

根據(jù)結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，獲滿(mǎn)意結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室22個(gè)，占參加單位的88%；不滿(mǎn)意結(jié)果有3個(gè)，占參加單位的12%。不滿(mǎn)意結(jié)果中，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室漏檢陽(yáng)性樣本結(jié)果，結(jié)果全部為陰性；另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室將陰性干擾樣品檢為陽(yáng)性。

3 討論

3.1 方法的選擇

在依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)支氣管鮑特桿菌時(shí)，血瓊脂上初代菌落的α溶血現(xiàn)象常不甚明顯，因此初代培養(yǎng)時(shí)以培養(yǎng)至40 h以上為宜。在初代培養(yǎng)時(shí)，同時(shí)接種DHL瓊脂平皿有助于可疑菌落的篩選。采用培養(yǎng)法時(shí)，根據(jù)CNAS-CL09[17]要求需對(duì)購(gòu)置的或自制的培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量控制。即用標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證相關(guān)培養(yǎng)基和試劑的有效性，避免培養(yǎng)基和試劑原因?qū)е碌呐囵B(yǎng)和鑒定失敗。

如不采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的分離培養(yǎng)方法，PCR方法可以快速得出結(jié)果[18-20]。PCR方法已經(jīng)寫(xiě)入豬病檢測(cè)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，用于檢測(cè)傳染性萎縮性鼻炎中支氣管鮑特桿菌的診斷[13]，效果優(yōu)于分離培養(yǎng)法[21]。本次能力驗(yàn)證參加實(shí)驗(yàn)室主要采用的仍是分離培養(yǎng)和生化鑒定的方法。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用了PCR方法，且其中一個(gè)為熒光定量PCR方法，均獲得了準(zhǔn)確的結(jié)果。

3.2 不滿(mǎn)意結(jié)果原因分析

通過(guò)查驗(yàn)不滿(mǎn)意實(shí)驗(yàn)室原始記錄和報(bào)告，檢測(cè)錯(cuò)誤的主要原因可能為操作時(shí)污染、可疑菌挑取錯(cuò)誤、生化鑒定錯(cuò)誤和原始記錄記錄不祥等幾個(gè)方面。對(duì)樣品的檢測(cè)操作應(yīng)在生物安全柜中操作，避免各種污染引入。處理樣品時(shí)，應(yīng)分裝保留部分樣品以備復(fù)檢。熟知陽(yáng)性菌落的形態(tài)和特征對(duì)挑取可疑菌至關(guān)重要，根據(jù)血瓊脂和DHL瓊脂培養(yǎng)基中的特征形態(tài)，充分挑取足夠數(shù)量的可疑菌落，可以避免漏檢。對(duì)于可疑菌的生化鑒定，本次比對(duì)中有19家單位采用的是手工生化檢測(cè)，其中9家實(shí)驗(yàn)室在原始記錄中未注明所使用生化試劑的品牌或來(lái)源，使用質(zhì)量不穩(wěn)定的生化試劑很可能誤導(dǎo)檢測(cè)結(jié)果的判斷。有三個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用自動(dòng)生化鑒定儀，一個(gè)采用梅里埃API生化鑒定條，結(jié)果均準(zhǔn)確。與此前能力驗(yàn)證情況相似，相比純手工生化鑒定，采用自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀或鑒定條可以獲得更準(zhǔn)確、穩(wěn)定的結(jié)果。值得注意的是支氣管鮑特桿菌檢測(cè)可能得出動(dòng)力陰性的結(jié)果。主要原因是支氣管鮑特桿菌在半固體培養(yǎng)基中延穿刺線生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)至7 d比較穩(wěn)妥[22]。原始記錄是反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果的第一手資料，是對(duì)檢測(cè)活動(dòng)的客觀反映，有助于檢測(cè)結(jié)果的追溯。原始記錄不詳或者錯(cuò)誤，可直接導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論。

3.3 總結(jié)

一次能力驗(yàn)證的結(jié)果只能證明參加者在本次能力驗(yàn)證活動(dòng)的情況，不能說(shuō)明其正常的檢測(cè)水平，只有持續(xù)參加同一項(xiàng)目的能力驗(yàn)證活動(dòng)，其總體結(jié)果才能反映實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力狀況[1]。截止到本次能力驗(yàn)證，連續(xù)參加4次及以上的有14家單位，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌能力驗(yàn)證活動(dòng)已經(jīng)得到了全國(guó)業(yè)內(nèi)的認(rèn)可。

本次驗(yàn)證中出現(xiàn)一例樣品管破碎情況。經(jīng)確認(rèn)后對(duì)樣品進(jìn)行了補(bǔ)寄。樣品破碎原因可能是由于干冰致使樣品管變脆后受擠壓導(dǎo)致。提示對(duì)樣品管的材質(zhì)應(yīng)有更高的要求，也督促我們進(jìn)一步完善和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能力驗(yàn)證計(jì)劃，努力提高能力驗(yàn)證樣品的質(zhì)量，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)事業(yè)更好發(fā)展。