倪家敏 李淼煊 張茜茜 賴夢雨 吳曉倩 楊東明 宋銀娟 廖 軼 姚 嬌 董浩迪 張 凱 楊利峰 趙德明 周向梅

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，國家動物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量直接影響著科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[1]。隨著生命科學(xué)和生物技術(shù)的飛速發(fā)展，對實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量的要求越來越高，定期對實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量進(jìn)行抽查是非常必要的。

本文主要是對北京22家實(shí)驗(yàn)動物繁育機(jī)構(gòu)2018年5月送檢的400只嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物的病理檢測結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，然后根據(jù)檢測結(jié)果對嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物的飼料、飼喂方式、飼養(yǎng)壞境等提出改進(jìn)方法，以確保嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

2018年5月，由中國食品藥品檢定研究院從北京市22家實(shí)驗(yàn)動物機(jī)構(gòu)抽檢的400只嚙齒動物，包括SPF級、清潔級、普通級三個(gè)級別；小鼠、大鼠、豚鼠、金黃地鼠、地鼠五個(gè)品種。具體種類、級別、數(shù)量見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

動物經(jīng)二氧化碳窒息法處死后，采取心臟，肝臟，腎臟，肺臟，脾臟，大腸，小腸，甲醛鈣液(10%甲醛+1%氯化鈣)固定，一周后修塊。常規(guī)病理組織學(xué)制片，石蠟包埋，5 μm切片，經(jīng)H.E.染色后置于光學(xué)顯微鏡觀察，采集數(shù)碼圖像，記錄結(jié)果。對H.E.染色結(jié)果顯示細(xì)胞異常腫脹的肝臟，制作冰凍切片進(jìn)行油紅O染色和石蠟切片進(jìn)行PAS染色，同樣置于光學(xué)顯微鏡觀察，采集數(shù)碼圖像并記錄。

表1 2018年5月嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物采樣情況Table 1 Classification of samples in May 2018

2 結(jié)果

2.1 小鼠檢查結(jié)果

包括SPF級150只，清潔級30只。檢出清潔級小鼠病變數(shù)1例(病變率3.3%)；其中肝臟異常1例(檢出率3.3%)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹，經(jīng)油紅O和PAS染色確診為脂肪變性。檢出SPF級小鼠病變數(shù)4例(病變率2.7%)；其中肝臟異常1例(0.7%)，表現(xiàn)為肝臟局灶性炎性細(xì)胞浸潤；另檢出化膿性肺炎 1例，大腸局灶性炎性細(xì)胞浸潤1例，腎臟集合管充滿粉染物質(zhì)，即腎管型 1例。

2.1.1肝臟病變：與正常肝臟相比(如圖1 A所示)，肝臟局灶性炎性細(xì)胞浸潤可見局灶性、孤島樣炎灶，與周圍正常組織界限清晰，炎性細(xì)胞呈圓形、卵圓形，胞漿為粉色、紫色，胞核清晰， 為圓形、多角形(如圖1B所示)；肝細(xì)胞腫脹可見肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，未見明顯肝索結(jié)構(gòu)，肝血竇變窄，肝細(xì)胞體積變大，胞質(zhì)中有不同程度的空泡出現(xiàn)(如圖1C所示)；對肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行油紅O染色和PAS染色，顯示肝臟脂肪變性，可見肝細(xì)胞輪廓和由蘇木素藍(lán)染的細(xì)胞核，并且可見較多紅色大小不一的圓形小滴分布在肝細(xì)胞胞漿中，有的圍繞在細(xì)胞核周圍，有的聚集呈大脂滴(如圖1D所示)。

2.1.2肺臟病變:與正常肺臟相比(如圖2A所示)；化膿性肺炎可見多個(gè)呈團(tuán)塊狀或島嶼狀的藍(lán)染局灶性區(qū)域，肺泡腔結(jié)構(gòu)基本消失，病變區(qū)域以大量的淋巴樣細(xì)胞浸潤為主，也可見較多分葉核的嗜中性粒細(xì)胞(如圖2B所示)。

2.1.3腎臟病變:與正常腎臟相比(如圖3A所示)，腎管型中可見集合管擴(kuò)張，管內(nèi)有均質(zhì)粉染的物質(zhì)，較小的集合管也可見均質(zhì)粉染的物質(zhì)(如圖3B所示)。

2.1.4大腸病變:與正常大腸相比(如圖4A所示)，大腸局灶性炎性細(xì)胞浸潤可見黏膜層中存在一明顯的局限性炎灶，與周圍組織界限清晰，炎性細(xì)胞成分多樣，散在排列(如圖4B所示)。

2.2 大鼠檢查結(jié)果

包括SPF級60只，清潔級20只。檢出清潔級大鼠病變數(shù)為2例(發(fā)病率10%)，為肝臟異常，表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹，經(jīng)油紅O染色和PAS染色，均為脂肪變性；檢出SPF級大鼠病變數(shù)為7例(病變率11.7%)；其中肝臟異常5例(檢出率3.3%)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹3例，經(jīng)油紅O染色和PAS染色全為陰性，肝臟局灶性炎性細(xì)胞浸潤 2例。另檢出2例嗜酸性粒細(xì)胞性心肌炎。

2.2.1肝臟病變:與正常肝臟相比(如圖5 A所示)，肝臟局灶性炎性細(xì)胞浸潤中可見炎性細(xì)胞結(jié)節(jié)，與周圍界限清晰，聚集的炎性細(xì)胞為胞核圓形、嗜堿性深藍(lán)染的淋巴樣細(xì)胞(如圖5B所示)；肝細(xì)胞腫脹中可見肝索界限不清晰，肝細(xì)胞體積變大，內(nèi)有大小不等、數(shù)量不等的空泡，有些空泡融合成大的空泡，枯否氏細(xì)胞明顯(如圖5C所示)；挑取肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行油紅O染色和PAS染色，顯示肝臟脂肪變性，可見較多紅色、大小不一的圓形小滴分布在肝細(xì)胞胞漿中(如圖5D所示)。

圖5 大鼠肝臟病變情況注：A：正常肝臟；B：肝臟局灶性炎性細(xì)胞浸潤；C：肝細(xì)胞腫脹；D：肝臟脂肪變性;A、B、C為H.E.染色(×400)；D為油紅O染色陽性(×1000)Fig.5 Pathological changes of livers in ratsNote：A.Normal liver; B. Focal inflammatory cells infiltration of liver; C. Hepatocellular swelling;D. Hepatic steatosis; A、B、C is H.E. staining(×400); D is Oil Red-O staining(×1000)

2.2.2心臟病變:與正常心臟相比(如圖6 A所示)，嗜酸性粒細(xì)胞性心肌炎可見局部區(qū)域心肌纖維出現(xiàn)斷裂、排列紊亂，其間有大量胞核呈圓形、藍(lán)染，胞漿較少的淋巴樣細(xì)胞和少量胞核藍(lán)染呈分葉核，胞漿紅染的嗜酸性粒細(xì)胞以及胞核呈圓形、胞體較大的巨噬細(xì)胞浸潤(如圖6B所示)。

圖6 大鼠心臟病變情況(H.E.×400)注：A：正常心臟；B：嗜酸性粒細(xì)胞性心肌炎Fig.6 Pathological changes of hearts in rats(H.E.×400)Note：A.Normal heart; B. Eosinophilic myocarditis

2.3 豚鼠檢查結(jié)果

包括SPF級20只，清潔級10只，普通級90只。發(fā)生病變主要是普通級豚鼠，共13例(病變率14.4%)。其中肝臟異常以肝細(xì)胞腫脹為主，共8例(病變率8.9%)，經(jīng)油紅O和PAS染色確診為脂肪變性1例；檢出肺臟局灶性增生1例、肉芽腫性肺炎1例、支氣管肺炎1例；檢出大腸疑似有數(shù)量不等的各種發(fā)育階段的球蟲2例。

2.3.1肝臟病變:與正常肝臟相比(如圖7A所示)，肝臟空泡變性中肝細(xì)胞排列較紊亂，中央靜脈及肝血竇紅細(xì)胞聚集，可見肝細(xì)胞體積變大，胞質(zhì)粉染且內(nèi)部存在大量大小不等的圓形空泡，可見較多的枯否氏細(xì)胞(如圖7B所示)；對肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行油紅O染色和PAS染色，顯示肝臟脂肪變性，可見較多紅色、大小不一的圓形小滴分布在肝細(xì)胞胞漿中(如圖7C所示)。

圖7 豚鼠肝臟病變情況

注：A：正常肝臟；B：肝臟空泡變性；C：肝臟脂肪變性;A、B為 H.E.染色(×400)；C為油紅O染色陽性(×1000)

Fig.7 Pathological changes of livers in guinea pigs

Note:A.Normal liver; B. Vacuolar degeneration;A、B is H.E.staining(×400); C is Oil Red-O staining,(×1000)

2.3.2肺臟病變:與正常肺臟相比(如圖8A所示)，局灶性增生可見肺臟局部出現(xiàn)增生，增生區(qū)域肺泡結(jié)構(gòu)消失，與周圍組織界限清楚，增生的細(xì)胞大小不等，胞核呈橢圓形至不規(guī)則形、藍(lán)染，胞漿紅染；其間可見較多紅細(xì)胞散布(如圖8B所示)；支氣管肺炎可見細(xì)支氣管中有大量中性粒細(xì)胞浸潤，形成膿性滲出，肺泡隔有不同程度的增厚(如圖8C所示)；肉芽腫性肺炎可見局部區(qū)肺泡腔結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞成分增多，間質(zhì)不同程度的淤血或出血，增多的細(xì)胞成分以胞核為分葉核，胞漿粉紅染的嗜中性粒細(xì)胞為主，還有可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及少量成纖維細(xì)胞等(如圖8D所示)。

圖8 豚鼠肺臟病變情況(H.E.×400)注：A：正常肺臟；B：肺臟局灶性增生；C：支氣管肺炎；D：肉芽腫性肺炎Fig.8 Pathological changes of lungs in guinea pigs(H.E.×400)Note：A.Normal lung; B. Focal hyperplasia; C. Bronchopneumonia; D. Granulomatous pneumonia

2.3.3大腸病變:與正常大腸相比(如圖9A所示)，病變大腸中在腸黏膜的固有層可見數(shù)量不等的各個(gè)發(fā)育階段的球蟲，腸黏膜固有層破壞，小血管充血，也可見出血，腸黏膜固有層可見淋巴小結(jié)(如圖9B所示)。

圖9 豚鼠大腸病變情況(H.E.×400)注：A：正常大腸；B：大腸中有數(shù)量不等的不同發(fā)育階段的球蟲Fig.9 Pathological changes of intestinum crassum in guinea pigs(H.E.×400)Note：A.Normal intestinum crassum; B. Some coccidia in intestinum crassum

2.4 地鼠檢查結(jié)果

金黃地鼠、地鼠分別取材10只，皆為清潔級。各組織未見明顯病理變化。

3 討論

3.1 肝臟病變的分析

肝臟病變主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹和局部炎性細(xì)胞浸潤，與2017年兩次抽檢結(jié)果相比基本杜絕了肝臟壞死的情況[2-3]。在肝細(xì)胞腫脹的樣本中，僅檢出油紅O染色陽性，PAS染色全為陰性，可能原因是實(shí)驗(yàn)動物飼料配方不合理所造成。肝臟局部炎性細(xì)胞浸潤則可能是由于飼料、飲水滅菌不徹底而導(dǎo)致微生物感染。

肝臟病變一般反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動物的飲食情況，因此，在實(shí)驗(yàn)動物的繁育過程中，飼料應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)的原料、合理恒定的配方及適宜的滅菌方法，動物飲水也應(yīng)使用滅菌的自來水[4]。

3.2 肺臟病變的分析

肺臟病變比例僅次于肝臟，且顯著高于2017年兩次抽檢結(jié)果中的肺臟病變比例[2-3]。肺臟病變主要表現(xiàn)為增生和炎癥，可能與墊料質(zhì)量不達(dá)標(biāo)或飼養(yǎng)密度過大有關(guān)，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物生活環(huán)境空氣質(zhì)量差而發(fā)生病變。本次結(jié)果中肺臟病變高于2017年則可能與2017年北京市空氣質(zhì)量提高，霧霾天數(shù)在近幾年中最低，而2018年上半年霧霾天氣頻頻出現(xiàn)。因此，實(shí)驗(yàn)動物的繁育過程中應(yīng)選用符合標(biāo)準(zhǔn)的墊料，飼養(yǎng)密度要合理，定期檢查動物房的通風(fēng)系統(tǒng)。

3.3 其他臟器的病變分析

除肝臟、肺臟外，本次檢測結(jié)果還顯示普通級豚鼠在大腸中疑似有球蟲感染的現(xiàn)象，這是在2017年抽檢中所沒有的。球蟲感染會對科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，其感染原因可能是因?yàn)閴|料未經(jīng)消毒直接使用；籠養(yǎng)空間狹小，排泄物易污染墊料和空氣，而飼養(yǎng)員沒有勤換墊料；飼料質(zhì)量不合格；直接飲用未經(jīng)處理的自來水。該實(shí)驗(yàn)動物繁育機(jī)構(gòu)的普通級豚鼠的飼養(yǎng)管理制度有必要查找不足，以期改善實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量[5]。

從檢測結(jié)果來看，本次病理學(xué)抽檢中的實(shí)驗(yàn)動物基本健康。檢測結(jié)果顯示，大鼠、小鼠肝臟有少數(shù)病例表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹，幾例肺臟、心臟局灶性炎性細(xì)胞浸潤；豚鼠病變主要集中在普通級，病變包括肝細(xì)胞腫脹，肉芽腫性肺炎、支氣管肺炎、肺臟局灶性增生，對大腸出現(xiàn)疑似球蟲感染的現(xiàn)象，應(yīng)與寄生蟲檢測結(jié)果綜合診斷；地鼠的組織臟器均未見明顯異常。