胡建武 李樹(shù)梅 梁俊仕 余光禎 李 亮 武會(huì)娟 陳禹保

(北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，北京 100012)

墊料是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存環(huán)境中的接觸性基礎(chǔ)材料，不同的墊料生存環(huán)境直接影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理活動(dòng)，進(jìn)而影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇不同墊料也是體現(xiàn)動(dòng)物福利的重要內(nèi)涵。因此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家及地方標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物墊料的物理性狀、化學(xué)及生物特性都有明確的規(guī)定和要求。目前所知實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種、品系、年齡、性別等對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶能力均有不同程度的影響，但未知不同墊料飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶認(rèn)知能力是否有影響。為了進(jìn)一步探索新型麥秸墊料的安全性及其對(duì)嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸環(huán)境的影響,本實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)昆明小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用MORRIS水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，比較、開(kāi)發(fā)利用新型麥秸墊料和其他3種墊料(刨花墊料、玉米芯墊料和紙質(zhì)墊料)在工作狀態(tài)下對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和血液生化指標(biāo)的影響。為今后開(kāi)展與改善學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)藥物研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物墊料選擇提供參考，也為新型麥秸墊料的安全使用和大力推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠 (孕13 d) 8只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]，飼養(yǎng)在北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心屏障設(shè)施內(nèi) [SYXK(京)2015-0046]，小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，溫度：18～26 ℃，濕度：38%～50%。維持12/12 h明暗交替光照。所有實(shí)驗(yàn)操作遵循動(dòng)物使用相關(guān)倫理要求，福利倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：BLARC-2017112401。

1.2 墊料及主要儀器

1.2.1新型麥秸墊料：利用蒸汽爆破工藝對(duì)麥秸稈原料進(jìn)行爆破，做進(jìn)一步處理后，進(jìn)行60Co照射及真空包裝后獲得新型麥秸墊料。玉米芯墊料、刨花墊料均購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司；紙質(zhì)墊料購(gòu)自北京美綠洲生物科技有限公司。

1.2.2主要儀器：超凈工作臺(tái)(蘇杭)；電子天平(Sartorius，BSA220ZS型)；水迷宮(ZS-001MORRIS)，ZS-001 MORRIS水迷宮動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(眾實(shí)迪創(chuàng)，購(gòu)自北京美綠洲生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組：8只KM孕鼠單籠飼養(yǎng)，2只/籠，分別飼養(yǎng)在麥秸墊料、玉米芯、刨花和紙質(zhì)4種墊料中。選取離乳后仔鼠24只，隨機(jī)分為4組，每組6只，雌雄各半，分別按照使用墊料的不同分為麥秸墊料組、玉米芯組、刨花組和紙質(zhì)墊料組。每周更換一次墊料，常規(guī)飼養(yǎng)。在相同環(huán)境條件下繼續(xù)飼養(yǎng)8周后，觀(guān)察各組小鼠的相應(yīng)指標(biāo)。

1.3.2適應(yīng)性觀(guān)察：觀(guān)測(cè)KM小鼠分別對(duì)4種墊料飼養(yǎng)適應(yīng)情況，觀(guān)察小鼠行為反應(yīng)、身體清潔度、有無(wú)外傷及過(guò)敏、嚼食墊料等情況。

1.3.3水迷宮行為學(xué)測(cè)試：應(yīng)用ZS-001 MORRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置，開(kāi)展隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)小鼠在水迷宮裝置中的學(xué)習(xí)和記憶能力。

1.3.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn)：連續(xù)6 d分別對(duì)麥秸、刨花、玉米芯及紙質(zhì)墊料飼養(yǎng)的4組小鼠進(jìn)行入水訓(xùn)練和測(cè)試，每天訓(xùn)練4次，確保4個(gè)象限每天只用1次。第一天為適應(yīng)性訓(xùn)練，將小鼠放入不含平臺(tái)的水池中自由游泳120 s，每次訓(xùn)練完成后，迅速用干凈的干毛巾將小鼠擦拭干凈后放回籠盒，并保證其飲水和食物供應(yīng)，便于小鼠提前適應(yīng)環(huán)境，減少應(yīng)激反應(yīng)。其余5 d為正式試驗(yàn)，每天固定時(shí)間訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練間隔15～20 min。訓(xùn)練時(shí)間設(shè)置為90 s，90 s內(nèi)小鼠未找到站臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)人員將其引導(dǎo)至站臺(tái)，并在站臺(tái)上停留10 s，逃避潛伏期記為90 s。將逃避潛伏期均值作為參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.3.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)時(shí)間為1 d，去除平臺(tái)中心支架，任選一個(gè)象限入水點(diǎn)將KM小鼠放入水中，測(cè)試60 s小鼠在恒溫池中的游泳時(shí)間以及穿越目標(biāo)(原平臺(tái)位置)的次數(shù)。

1.3.4體質(zhì)量的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)期間，每天實(shí)驗(yàn)前對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱(chēng)重并記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物適應(yīng)性研究

通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察，麥秸墊料對(duì)小鼠無(wú)刺激作用，小鼠行為、反應(yīng)正常。同其他3種墊料相比，換墊料1周后，麥秸墊料相對(duì)干燥度良好；相比玉米芯墊料，沒(méi)有尿液集中滲漏的情況；相比紙質(zhì)墊料，沒(méi)有排泄物裸置的情況。

2.2 定位航行實(shí)驗(yàn)

逃避潛伏期結(jié)果如表1所示。在5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠的潛伏期均隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而縮短，由此可知，在4種墊料飼養(yǎng)環(huán)境下的KM小鼠經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后均可獲得一定的空間學(xué)習(xí)能力。由圖1可見(jiàn)，自第2天起，麥秸組、玉米芯組和紙質(zhì)組的潛伏期呈下降趨勢(shì)，其中麥秸組較其他3種墊料組具有明顯的優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步對(duì)組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的潛伏期進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，第5天的潛伏期麥秸組顯著低于其他3組(P<0.05)，其余各組間兩兩比較差異不顯著，由此可見(jiàn)經(jīng)麥秸墊料飼養(yǎng)下的KM小鼠在空間學(xué)習(xí)能力可得到明顯的提高。

表1 KM小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(定位航行)Table 1 Results of Morris water maze(place navigation) test in KM mice

注：*P<0.05

Note:*P<0.05

2.3 空間探索實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，各組小鼠穿過(guò)目標(biāo)象限次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時(shí)間經(jīng)統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。但麥秸組的小鼠在穿過(guò)目標(biāo)象限的總次數(shù)、游泳時(shí)間上均表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，其中穿臺(tái)次數(shù)方面：麥秸組(3、2)最高、刨花組(1、2)、玉米芯組(1、2)，紙質(zhì)組(1)；游泳時(shí)間方面：麥秸組(17.09 s)、刨花組(11.22 s)、玉米芯組(12.21 s)、紙質(zhì)組(16.33 s)。這說(shuō)明在麥秸墊料飼養(yǎng)條件下的KM小鼠可獲得良好的空間學(xué)習(xí)記憶能力，其對(duì)空間定位的準(zhǔn)確性明顯高于其他3組。

圖1 不同墊料組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of the place navigation testin different bedding groups of mice

圖2 KM小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of the spatial probe test in KM mice

2.4 墊料對(duì)KM小鼠體質(zhì)量的影響

KM小鼠經(jīng)四種不同墊料相同飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)8周后，體質(zhì)量均逐漸增加，結(jié)果見(jiàn)表2。其中麥秸組增重最大，刨花組增重最小，兩組間變化差異顯著(P<0.05)；水迷宮測(cè)試期間，各組增重兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果如圖3所示。

表2 不同墊料對(duì)KM小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effects of different beddings on body weight of KM mice

注：*P<0.05

Note:*P<0.05

圖3 各組小鼠水迷宮試驗(yàn)期間體質(zhì)量增加百分比Fig.3 The increased body weight percentage ofeach group during the water maze test

3 討論

目前，MORRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)廣泛用于開(kāi)展海馬功能、學(xué)習(xí)記憶機(jī)制、衰老、藥物對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙的改善、某些疾病對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響以及新藥的研發(fā)、藥物機(jī)型篩選、療效評(píng)價(jià)、衰老模型評(píng)價(jià)、康復(fù)醫(yī)學(xué)以及藥物毒理學(xué)研究等領(lǐng)域[1]。根據(jù)MORRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)原理可知，小鼠的自身生理因素和環(huán)境因素均會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。李?lèi)?ài)萍等[2]報(bào)道，受動(dòng)物品系及遺傳背景的影響，在MORRIS水迷宮中不同品系的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力差異較為明顯。Wahlsten等[3]選用8個(gè)近交品系小鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)C57BL/6和DBA/2 J在迷宮試驗(yàn)中表現(xiàn)良好，薛丹等[4]報(bào)道，C57BL/6小鼠、KM小鼠和ICR小鼠都能完成MORRIS水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)、空間搜索實(shí)驗(yàn)和工作記憶實(shí)驗(yàn)，且非空間因素對(duì)C57BL/6小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的評(píng)價(jià)干擾較小。諸多學(xué)者以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用MORRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)開(kāi)展了神經(jīng)退行性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腦認(rèn)知系統(tǒng)的相關(guān)研究方面。如Huang等[5]研究脂多糖對(duì)記憶檢索的影響，探討免疫激活與學(xué)習(xí)記憶功能的相互作用。Stackman等[6]研究小鼠定向反應(yīng)與前丘腦神經(jīng)元之間的關(guān)聯(lián)。范琳犀等[7]研究發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)酮慢性注射可誘導(dǎo)C57小鼠抑郁行為發(fā)生改變并損害學(xué)習(xí)記憶功能。劉港等[8]研究結(jié)果表明，采用雄性KM小鼠側(cè)腦室注射Aβ25-35可快速成功制備阿爾茨海默病(AD)小鼠模型。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，KM小鼠的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加而減少，這與本研究的結(jié)果一致。王南溪等[9]用水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試不同劑量的黃粉蟲(chóng)油脂對(duì)KM小鼠增重及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。胡華等[10]探討活血榮絡(luò)片治療阿爾茨海默病的機(jī)制。在MORRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，其測(cè)試結(jié)果不僅與動(dòng)物種類(lèi)有關(guān)，MORRIS水迷宮的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)環(huán)境(光照、噪聲)等許多因素均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。周海東等[11]發(fā)現(xiàn)平臺(tái)顏色可以改變大鼠的水迷宮成績(jī)，藍(lán)色平臺(tái)的大鼠學(xué)習(xí)能力提升速度快于白色平臺(tái)組。黃明[12]發(fā)現(xiàn)90 dB的噪聲(2 h/天)可以導(dǎo)致KM小鼠空間性學(xué)習(xí)記憶能力和情緒性記憶能力受損。

眾所周知，墊料作為嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存環(huán)境中的重要組成部分，其原料、形狀、大小等因素均會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果有不同程度的影響[13]。越來(lái)越多的研究表明，豐富環(huán)境可以對(duì)小鼠腦損傷具有復(fù)蘇的作用，可以改善其記憶和運(yùn)動(dòng)能力，認(rèn)為環(huán)境豐富化對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物腦功能改善、減輕老齡化帶來(lái)的空間認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)缺陷等具有重要生物學(xué)意義[14-15]。

唐莉莉[16]研究發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境組的KM小鼠表現(xiàn)活躍，探索主動(dòng)性增加，豐富環(huán)境強(qiáng)化小鼠的情緒學(xué)習(xí)記憶；而貧瘠環(huán)境組小鼠活動(dòng)減少、情緒煩躁不安，氧化應(yīng)急水平下降，使機(jī)體抵抗外界不良環(huán)境的能力下降。吳冰潔等[17]通過(guò)對(duì)近交系衰老模型SAMP8小鼠的研究也發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了環(huán)境豐富能刺激、提高動(dòng)物體內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醇(Cor)水平，能減輕精神行為異常及顯著提高小鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力。李春祿等[18]通過(guò)對(duì)野生小家鼠和KM小鼠對(duì)豐富環(huán)境(鋸末墊料為主，普通環(huán)境基礎(chǔ)上添加玩具)的學(xué)習(xí)記憶能力影響實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)早期的豐富環(huán)境飼養(yǎng)顯著縮短野生小家鼠的潛伏期，KM小鼠沒(méi)有顯著影響，而經(jīng)過(guò)學(xué)習(xí)訓(xùn)練野生小家鼠和KM小鼠的潛伏期都顯著縮短。野生小家鼠更有良好的可塑性和應(yīng)變能力，而實(shí)驗(yàn)KM小鼠經(jīng)過(guò)馴化后對(duì)環(huán)境變化更容易適應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用KM小鼠作為研究對(duì)象，這與我們的研究結(jié)果一致。但是，在刨花與玉米芯等常規(guī)墊料飼養(yǎng)中，結(jié)果顯示在4種墊料飼養(yǎng)環(huán)境下的KM小鼠經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后均可獲得一定的空間學(xué)習(xí)能力，自第2天起，麥秸組、玉米芯組和紙質(zhì)組的潛伏期呈下降趨勢(shì)，其中麥秸組較其他3種墊料組具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但差異不顯著。

據(jù)報(bào)道，大小鼠的迷宮實(shí)驗(yàn)認(rèn)知和行為評(píng)價(jià)的差異也可能和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[19]，應(yīng)激狀態(tài)下人類(lèi)和動(dòng)物釋放的腎上腺皮質(zhì)激素影響記憶的形成，損害記憶的獲得和再現(xiàn)。在水迷宮浸水游泳的環(huán)境應(yīng)激下，除了因整體環(huán)境因素如墊料富集，增加小鼠的幸福感等對(duì)小鼠形成的保護(hù)作用，也應(yīng)該考慮到小鼠個(gè)體差異。我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠的認(rèn)知能力顯著高于雄性，這與宿瑞敏[20]研究結(jié)果相一致。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新型麥秸墊料可促進(jìn)KM小鼠體質(zhì)量增加，且增加情況要優(yōu)于玉米芯和紙質(zhì)墊料組，與刨花墊料組相比較差異顯著(P<0.05)；舒暢等[21]曾報(bào)道普通刨花墊料對(duì)KM小鼠體質(zhì)量的增加緩慢，本次結(jié)果與之相一致。水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，4種墊料飼養(yǎng)下的小鼠差異不顯著，但結(jié)合實(shí)際飼養(yǎng)環(huán)境來(lái)看，紙質(zhì)墊料組的小鼠表現(xiàn)欠佳，不建議完全用紙質(zhì)墊料飼養(yǎng)或開(kāi)展相關(guān)研究。麥秸墊料組表現(xiàn)則明顯優(yōu)于刨花墊料和玉米芯墊料組，因此麥秸墊料可以作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸性墊料推廣使用。