張盼陽 王昭昕 袁曉美 畢亞男 張 玥,2 周 昆,2

(1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193)(2.天津中醫(yī)藥大學方劑學教育部重點實驗室，天津 300193)

補骨脂，復方制劑壯骨關節(jié)丸中的一味組方中藥材，系豆科植物補骨脂PsoraleacorylifoliaLinn.的干燥成熟果實，始載于《雷公炮炙論》，又名破故紙。其性溫，味辛、苦，用于補腎助陽，納氣平喘，溫脾止瀉。補骨脂中的主要活性成分有香豆素類、香豆酮苷、黃酮類化合物和單萜類[1-2]。補骨脂酚在補骨脂中含量達3%以上，研究表明其具有抗癌、抗抑郁、降糖降血脂等多種藥理活性[3-5]，補骨脂酚具有顯著的雌激素樣作用[6]，其在骨質(zhì)疏松、圍絕經(jīng)期綜合征等疾病的治療具有良好的應用前景[7]，劉穎等[8]實驗表明補骨脂藥渣對骨質(zhì)疏松有良好的治療效果，且優(yōu)于補骨脂生藥和水提物。但未見關于補骨脂酚對雄性骨質(zhì)疏松療效的研究，故本文就補骨脂中含量較高成分的補骨脂酚對雄性小鼠抗骨質(zhì)疏松效果進行研究。

1 材料與方法

1.1 受試藥

補骨脂酚，經(jīng)HPLC檢測純度大于95%，購于天津月牙湖科技有限公司。

1.2 動物

雄性ICR小鼠，56只，SPF級，體質(zhì)量20～22 g，6周齡，購自于北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號SCXK(京)2014-0004)，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心。自由攝食和飲水，飼料來自于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度40%～60%。

1.3 試劑

阿侖膦酸鈉片，批號：J20130085，Merck Sharp & Dohme Italia Spa；

試劑盒：骨鈣素(OC)ELSIA，批號：L150401078，CUSABIO；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)試劑盒，批號：P032G-4，碧云天生物技術研究所；堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒批號：140721，中生北控生物科技股份有限公司;注射用青霉素納，批號：017140656，中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司產(chǎn)品；氯化鈉注射液，批號：141128,安徽雙鶴藥業(yè)責任有限公司產(chǎn)品;75%酒精，批號：141002，德州格利潔消毒制品有限公司產(chǎn)品；無水乙醇，批號：20150131，天津市科密歐化學試劑有限公司產(chǎn)品；水合氯醛，批號：20130705，天津市光復精細化工研究所產(chǎn)品；甲醛溶液，批號：20141204，天津市風船化學試劑科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 儀器

JA1003電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)；VivaCT40小動物活體斷層掃描儀(瑞士，SCANCO MEDICAL)；YLS-16A小動物骨骼強度測定儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司)；7020全自動生化儀(日本，Hitachi)；EnSpire多模式微孔板檢測儀(美國，PerkinElmer)；Legend Micro 17 微量臺式離心機(Thermo)；RM2135轉(zhuǎn)輪切片機(德國，LEICA)；EG1150H包埋機(德國，LEICA)；CV5030全自動封片機(德國，LEICA)；ST5010全自動染色機(德國，LEICA)。

1.5 方法

1.5.1造模：小鼠進行適應性飼養(yǎng)2周后進行手術，術前12 h禁食，給藥組和模型組動物進行手術去勢，建立性激素缺乏的骨質(zhì)疏松模型。腹腔注射5%水合氯醛(350 mg/kg體質(zhì)量)進行麻醉，置仰臥式平鋪于手術臺，將小鼠睪丸從腹腔推入陰囊中，在陰囊部切約為1 cm的切口，把睪丸結扎并剪去，之后縫合傷口；對照組做剪去睪丸周圍一塊脂肪的假實驗。手術后，小鼠腹腔注射青霉素注射液5萬單位/只，連續(xù)3 d。

1.5.2分組及給藥：56只ICR小鼠隨機分為對照組Con(假手術)、去勢模型組Mod、陽性藥組AS(阿侖膦酸鈉20 mg/kg)和補骨脂酚組B10、B20(10 mg/kg和20 mg/kg) ，對照、模型和陽性藥組與“壯骨關節(jié)丸對小鼠骨質(zhì)疏松的治療”實驗[9]共用。造模成功后飼養(yǎng)6周后給藥，補骨脂酚使用注射用油配制，腹腔注射給藥；阿侖膦酸鈉灌胃給藥，依據(jù)動物體質(zhì)量給予藥物體積0.2 mL/10 g，每天給藥一次，連續(xù)8周，對照組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水。

1.5.3動物樣本處理：給藥8周后，取材。取材前12 h禁食不禁水，眼內(nèi)眥取血，血樣放置離心管中，1 h后離心10 min，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，吸取上清，貯存于-20 ℃冰箱中待測；取各組小鼠右腿脛骨，置于75%乙醇中3 d，每天換液，于第4天置于無水乙醇中保存用于骨密度檢測；取各組小鼠左腿脛骨放置于甲醛中保存待測；取各組小鼠雙腿股骨用于骨生物力學測定。

1.5.4血清生化指標的檢測：血清中TRACP按照試劑盒說明書進行檢測；Osteocalcin采用酶聯(lián)免疫雙抗夾心法進行檢測；ALP由全自動生化儀檢測而來。

1.5.5骨密度指標的檢測：使用VivaCT 40掃描右腿脛骨，進行三維骨密度分析。從脛骨近心端的骨垢線消失處開始、向遠心端進行掃描，每張厚度10.6 μm，取70張進行分析。指標為骨體積分數(shù)BV/TV、骨小梁數(shù)目Tb.N、骨小梁厚度Tb.Th、骨小梁分離度Tb.Sp和DA。

1.5.6骨最大荷載的檢測：小鼠股骨的最大荷載由YLS-16 A小動物骨骼強度測定儀檢測，最大荷載用Mode 1折斷模式檢測。

1.5.7病理學觀察：取左腿脛骨固定于10%甲醛溶液中，甲醛液固定的膝關節(jié)，經(jīng)過8%的鹽酸和8%的甲酸混合液脫鈣后用LEICA EG1150H包埋機石蠟包埋，用RM2135轉(zhuǎn)輪切片機進行5 nm切片，H & E染色，光鏡下對骨關節(jié)進行病理組織學評價。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 對血清生化指標的影響

與對照組相比，模型組骨鈣素OC值顯著升高，B10、B20劑量組與模型組相比顯著下降；小鼠的ALP、TRACP和ALP/TRACP各組間的值無顯著性差異性，見表1。

表1 給藥8周去勢小鼠血清生化指標Table 1 Serum biochemical indicators of castrated mice at 8 weeks of

注：與對照組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01

Note: compared with control group,#P<0.05; compared with model group,*P<0.05,**P<0.01

2.2 對骨密度相關指標的影響

CT掃描的3D結構顯示，模型組動物的骨小梁明顯減少、斷裂較多、間隙較大，而經(jīng)過給藥治療之后骨小梁數(shù)量有了明顯增加，見圖1。

圖1 小鼠骨CT掃描典型圖片注：Con 對照組、Mod去勢模型組、AS阿侖膦酸鈉組、B10和B20為補骨脂酚10和20 mg/kg組Fig.1 Typical picture of mouse bone CT scanNote: Con, control group; Mod, model group; AS, Alendronate Sodium group; B10 and B20 are bakuchiol 10 and 20 mg/kg groups

相比對照組，小鼠模型組相對骨體積和骨小梁數(shù)量顯著性降低，骨小梁厚度和分離度顯著升高；給藥后，各給藥組與模型組相比骨小梁數(shù)量顯著升高，陽性藥組和B20組骨小梁分離度和各向異性的程度顯著降低，陽性藥組骨小梁厚度顯著性降低，見表2。

表2 給藥8周去勢小鼠骨密度相關指標Table 2 Correlation index of bone mineral density in ovariectomized mice at 8

注：與對照組相比，#P<0.05,##P<0.01，###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001

Note: compared with control group,#P<0.05,##P<0.01，###P<0.001; compared with model group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.3 對骨最大荷載的影響

與對照組相比，模型組小鼠脛骨的最大荷載能力明顯降低(P<0.01)。經(jīng)過8周給藥治療后，各給藥組較模型組相比，脛骨最大荷載均顯著增高，見圖2。

圖2 給藥后雄小鼠的骨最大荷載注：Con 對照組、Mod去勢模型組、AS阿侖膦酸鈉組、B10和B20為補骨脂酚10和20 mg/kg組，與對照組相比， ## P<0.01； 與模型組相比， **P<0.01,***P<0.001Fig.2 Maximum bone load of male mice after administrationNote: Con, control group; Mod, model group; AS, Alendronate Sodium group; B10 and B20 are bakuchiol 10 and 20 mg/kg groups.compared with control group, ## P<0.01; compared with model group,**P<0.01,***P<0.001

2.4 骨組織學檢測

如圖3，對照組動物脛骨上端骺板軟骨細胞柱狀排列整齊，無軟骨細胞壞死區(qū)存在，骨小梁形成較多，粗壯、飽滿，壁較厚，形態(tài)結構完整，排列緊密有序呈網(wǎng)狀，密度、面積正常，間隙較小。模型組動物骨小梁數(shù)目明顯減少，呈團塊狀，骨小梁間隙增大，關節(jié)面骺板下過渡骨小梁數(shù)目減少，其余未見明顯變化。給藥后，陽性藥補骨脂酚治療組與模型組相比，各組骨小梁數(shù)目均有所增多，膜下生骨增多，骨小梁間隙減小。

圖3 雄性小鼠典型脛骨病理圖片注：Con 對照組、Mod去勢模型組、AS阿侖膦酸鈉組、B10和B20為補骨脂酚10和20 mg/kg組Fig.3 Typical tibia pathology pictures of male miceNote: Con, control group; Mod, model group; AS, Alendronate Sodium group; B10 and B20 are bakuchiol 10 and 20 mg/kg groups.

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下、骨微結構破壞、導致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。 目前大多使用雌性動物進行骨質(zhì)疏松研究，忽視了男性骨質(zhì)疏松的研究，但是隨著人口老齡化，男性性腺功能減退，雄激素分泌減少，65歲以上的男性普遍存在程度不等的骨質(zhì)疏松，病情的嚴重性和骨折后死亡率高于女性。骨組織對性激素很敏感，男性體內(nèi)的睪酮主要來自于睪丸，故本實驗采用將睪丸切除，建立雄性小鼠骨質(zhì)疏松模型[10]。

雙磷酸鹽類是臨床上應用廣泛的抗骨質(zhì)疏松癥藥物，但隨著雙磷酸鹽類藥物抑制破骨細胞時間的延長，造骨細胞也會受到影響，可能導致下頜骨壞死、腎臟毒性等副作用。而中藥有著多年的臨床應用，相對安全性較好，因此從中藥中尋找抗骨質(zhì)疏松有效成分是一個可行的途徑。本研究表明，補骨脂酚對于去勢導致的雄性小鼠骨質(zhì)疏松有較好治療作用，提示其可以作為男性骨質(zhì)疏松治療的潛在有效化合物，進而作為候選化合物進行后續(xù)優(yōu)化和開發(fā)研究。