王金明，徐慧淼，閆子鵬，楊鎵蓉，朱雅雅，成小芳，王俊東

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氟中毒及補(bǔ)鈣干預(yù)大鼠骨骼差異蛋白的分離與鑒定

王金明1，徐慧淼1，閆子鵬1，楊鎵蓉1，朱雅雅1，成小芳2，王俊東1

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院山西 太谷 030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801

為從蛋白水平探索鈣緩解氟中毒的作用機(jī)制，本試驗建立氟中毒和補(bǔ)鈣干預(yù)動物模型進(jìn)行骨骼差異蛋白的分離鑒定。通過雙向凝膠電泳技術(shù)(Two-dimensional electrophoresis，2-DE) 和基質(zhì)輔助質(zhì)量飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS) 鑒定骨骼中的差異蛋白質(zhì)，并通過gene ontology (GO) 注釋、pathway富集和互作網(wǎng)絡(luò)對差異蛋白進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與對照組 (C) 相比，在氟中毒組 (F) 和氟中毒補(bǔ)鈣組 (F+Ca) 中有17種差異性的蛋白，包括Ⅰ型膠原蛋白 (Col1a1)、肌動蛋白 (Actb)、蛋白質(zhì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2 (Tgm2) 等。這些差異蛋白富集到黏著斑 (Focal adhesion)、PI3K-Akt信號通路、AMPK信號通路等38條骨代謝通路。并且這些蛋白的功能主要與細(xì)胞骨架、能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、離子通道、細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此推測，鈣可能通過調(diào)控黏著斑、PI3K-Akt、AMPK等信號通路進(jìn)而緩解氟對骨骼帶來的損傷，具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步驗證。

氟中毒，鈣，骨組織，雙向電泳，差異蛋白

氟中毒是全世界廣泛存在的一種人畜共患地方性中毒病，該病危害嚴(yán)重、分布廣泛、難以治愈。過量的氟可導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷，骨骼和牙齒是受其威脅的主要靶器官和組織，主要臨床表現(xiàn)是氟骨癥和氟斑牙[1-2]。

高氟不僅可使骨硬化、骨軟化，還可引起骨質(zhì)疏松及骨周圍軟組織化骨。近年來對氟骨癥的骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)研究表明，中毒后的骨骼結(jié)構(gòu)松散、著色不均，Havers氏系統(tǒng)受損[3]。Yan等對大鼠飼喂含有NaF的去離子水120 d后，取脛骨和股骨進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察后發(fā)現(xiàn)，中毒后的骨小梁數(shù)目、體積均降低，形狀不規(guī)則，且骨組織中膠原纖維斷裂、腫脹、排列紊亂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受損[4]。Zhang等發(fā)現(xiàn)，高劑量的氟還可影響骨細(xì)胞DNA的合成并誘導(dǎo)骨細(xì)胞凋亡[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，鈣或含鈣化合物對一定條件下的氟中毒能起到適當(dāng)?shù)念A(yù)防和治療作用[6]，可明顯緩解氟中毒帶來的骨質(zhì)損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[7]。關(guān)于鈣對氟中毒的緩解機(jī)制，可能會通過影響氟的吸收、骨轉(zhuǎn)換、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等過程，從而改變氟對機(jī)體的損傷作用[8]。

蛋白質(zhì)是生命活動的重要體現(xiàn)者，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著后基因組時代的到來，蛋白組學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。其中蛋白質(zhì)雙向電泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE) 是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的分離和鑒定技術(shù)手段，能有效地查找差異蛋白[9-10]。基質(zhì)輔助質(zhì)量飛行時間質(zhì)譜技術(shù) (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS) 具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高和分辨率高等特點(diǎn)[11-12]，可與多種蛋白質(zhì)分離方法相結(jié)合。目前，2-DE和MALDI-TOF MS已成為許多研究者對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行比較和鑒定的常用方法。

因此本研究以試驗周期為120 d的正常組 (C)、染氟組 (F)、染氟補(bǔ)鈣組 (F+Ca) SD大鼠的股骨組織提取的蛋白質(zhì)為樣本，采用蛋白質(zhì)2-DE和MALDI-TOF MS技術(shù)以及生物信息學(xué)分析，從蛋白組學(xué)水平研究氟和鈣對骨組織蛋白表達(dá)的影響，分析差異蛋白的功能及關(guān)系，在蛋白水平解釋鈣對骨骼氟中毒緩解的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

30只SD雄性大鼠，體重120 g左右，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。氟化鈉 (NaF)、濃鹽酸、溴酚藍(lán)和氫氧化鈉均為分析純，購自北京化工廠；RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑 (PMSF) 購自碧云天(Beyotime)公司；IPG膠條購自Bio-Rad公司；胰酶購自Promega公司；快速蛋白銀染試劑盒購自中科瑞泰 (北京) 生物科技有限公司。VersaDoc?成像系統(tǒng) (德國Bio-Rad)、電泳槽 (GE ETTAN DALTsix)、等電聚焦儀 (GE ETTAN IPGPHOR3)、UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀 (德國布魯克Bruker Dalton)。

1.2 動物模型

30只大鼠購買后飼喂普通飼料，自由飲水，一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分為3組，分別為C組、F組、F+Ca組，每組10只。動物模型建立按表1進(jìn)行處理[13]。試驗期間所有大鼠均以自由采食和自由飲水的方式飼養(yǎng)，每只每天喂食30 g，采用12 h光照和12 h黑暗，溫度控制在22 ℃–25 ℃，濕度控制在55%–60%范圍內(nèi)，定期更換墊料，保證良好的飼養(yǎng)環(huán)境，試驗周期為120 d[14]。

1.3 骨氟含量測定

取1–1.5 g的股骨中段置于坩堝中，馬弗爐灰化后研碎。取研碎的骨灰20–25 mg置于25 mL容量瓶內(nèi)，加入0.25 mol/L鹽酸溶液5 mL使其溶解，然后加一滴溴酚藍(lán)，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中和至剛顯藍(lán)色 (pH 4)，加入12.5 mL總離子強(qiáng)度緩沖溶液 (TISAB)，定容[14]。倒出溶液至聚乙烯塑料杯中，待電位平衡后用氟離子電極測定其濃度。用此方法首先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時進(jìn)行樣本測定。通過下列公式計算出股骨的氟含量。

=/×25

式中：表示股骨中氟的含量 (μg/g)；為脛骨樣品待測液中氟的濃度 (μg/mL；為股骨濕重 (g)；25為待測液總量 (mL)。骨氟結(jié)果采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件的One-way analysis of variance (ANOVA)方法進(jìn)行，數(shù)據(jù)表示使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較使用LSD進(jìn)行顯著性檢驗，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

表1 動物模型的建立

1.4 蛋白質(zhì)提取

參照王簕等對兔骨總蛋白的提取方法[15]，用骨鉗截取適量的靠近股骨頭近端的大鼠股骨并迅速放入預(yù)冷并加有液氮的研缽中，快速研磨至粉末狀，然后將粉末狀的股骨放入含有RIPA裂解液(按每50 mg骨組織加入200 μL裂解液) 的1.5 mL EP管中，加入與RIPA體積比為99∶1的蛋白酶抑制劑 (PMSF)。振蕩2–3 min，然后將EP管置于冰上，靜置裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清用Bradford法定量測定蛋白含量[16]，然后取其上清液分裝并置于?80 ℃ 保存。

1.5 雙向電泳

等電聚焦：沿著聚焦盤中槽的邊緣至左而右線性加入250 μg樣品。將IPG膠條 (24 cm pH 4–7) 放入聚焦盤，并一起放入等電聚焦儀中，設(shè)置等電聚焦程序。聚焦程序為：無電壓水化12 h (20 ℃)；250 V線性升壓30 min；500 V快速升壓1 h；1 000 V快速升壓1 h；10 000 V線性升壓5 h；10 000 V快速升壓，整個聚焦過程中最終累積增壓達(dá)到90 000 V/h，完成等電聚焦。該過程結(jié)束后膠條進(jìn)行平衡。

SDS-PAGE：分離膠濃度為12%，電泳條件為10 mA/gel 1 h，20 mA/gel 10–12 h，直到溴酚藍(lán)遷移至分離膠底部。每個樣本重復(fù)3次。凝膠染色方法為硝酸銀染色。

1.6 圖像采集及分析

圖像采集采用VersaDoc?成像系統(tǒng)，用PDQuest圖像軟件分析與參考膠相比有特異表達(dá)、表達(dá)量上調(diào)或者下調(diào)2.5倍以上的差異蛋白點(diǎn)。

1.7 MALDI-TOF-MS分析

將2.5倍以上的差異蛋白點(diǎn)挖出，用胰酶進(jìn)行膠內(nèi)消化后將樣品與基質(zhì)液CHCA (a-氰基-4羥基肉桂酸) 按照1∶1進(jìn)行混合，取1 μL樣品點(diǎn)靶后用UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀對差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)荷比 (/) 檢測范圍設(shè)定為350–1 300/，采用正離子和自動獲取數(shù)據(jù)的模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，將所得到的肽片段質(zhì)量數(shù)據(jù)通過MASCOT搜索引擎檢索，用UniProt數(shù)據(jù)庫檢索蛋白質(zhì)功能。

1.8 GO注釋

GO (Gene ontology) 可標(biāo)準(zhǔn)化地統(tǒng)一描述生物體系中基因及其產(chǎn)物的生物學(xué)功能。GO共有三級結(jié)構(gòu) (Ontology)，包括描述基因的分子功能 (Molecular function)、所處的細(xì)胞組分 (Cellular component) 以及參與的生物過程 (Biological process)。采用DAVID分析系統(tǒng)對差異蛋白進(jìn)行GO富集分析[17]。

1.9 差異蛋白的pathway富集分析

差異蛋白ID號導(dǎo)入DAVID分析系統(tǒng)，找出顯著性富集的KEGG pathway。通過pathway顯著性富集確定差異蛋白參與的最主要生化路徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[17]。

1.10 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

釆用STRING-Known and Predicted Protein- Protein Interactions數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析。STRING數(shù)據(jù)庫使用最短的枝干將因子間進(jìn)行連接，歐氏距離較近說明兩個因子性質(zhì)較近，距離較遠(yuǎn)說明關(guān)聯(lián)較遠(yuǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠生長狀況及骨氟含量

對照組大鼠生長狀態(tài)正常，精神狀態(tài)良好，被毛正常有光澤，反應(yīng)靈敏，牙齒完整。染氟組大鼠生長狀態(tài)較差，精神狀態(tài)異常，有些出現(xiàn)過度亢奮，被毛暗淡無光澤，牙齒出現(xiàn)白堊樣不透明性改變。染氟補(bǔ)鈣組大鼠狀態(tài)均較染氟組狀態(tài)好，牙齒白堊樣不透明狀態(tài)也有所改善。提示氟中毒對骨相組織有明顯的損傷，而補(bǔ)充鈣可一定程度上緩解氟對硬組織的毒性作用。各組大鼠骨氟含量見圖1，與對照組相比，試驗期120 d氟中毒大鼠骨氟含量顯著升高 (<0.001)。與氟中毒組相比，氟中毒補(bǔ)鈣組大鼠骨氟含量顯著降低 (<0.001)。表明補(bǔ)鈣對骨骼氟含量的沉積有明顯的緩解作用。

2.2 雙向電泳圖譜分析

經(jīng)過等電聚焦、SDS-PAGE分離、硝酸銀染色以及圖像掃描后，分析不同組別差異蛋白的2-DE凝膠圖譜 (圖2、3、4、5)。經(jīng)Image Master 2D Platinum software 對2-DE膠分析后，以對照組為參考膠，蛋白表達(dá)量在F組和F+Ca組都有差異的蛋白點(diǎn)共鑒定出17種。以C組為參考，其中蛋白表達(dá)量在F和F+Ca組均上調(diào)且F組上調(diào)程度大于F+Ca組的蛋白點(diǎn)為A47 (E135)、A53 (E178)、A76 (E225)、A82 (E243)、A85 (E252)；在F組上調(diào)且在F+Ca組下調(diào)的蛋白點(diǎn)為A12 (E26)、A23、A45 (E115)、A74 (E224)，這9種差異蛋白點(diǎn)為氟可使蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而鈣可以緩解氟中毒所致蛋白表達(dá)的上調(diào)。在F組下調(diào)且在F+Ca組上調(diào)的蛋白點(diǎn)為B84 (F61)、B94 (F67)、B125 (F106)；在F組和F+Ca組均下調(diào)且F組下調(diào)程度大于F+Ca組的蛋白點(diǎn)為B38 (F28)、B72 (F46)、B77 (F56)、B99 (F72)、B106 (F76)，這8種差異蛋白點(diǎn)為氟中毒可使蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而補(bǔ)鈣可以抑制氟引起的蛋白表達(dá)量下降。括號內(nèi)為重復(fù)點(diǎn)。

圖1 各實驗組大鼠骨氟含量

圖2 F組上調(diào)的差異蛋白

圖3 F組下調(diào)的差異蛋白

圖4 F+Ca組上調(diào)的差異蛋白

圖5 F+Ca組下調(diào)的差異蛋白

2.3 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

對這17種差異2.5倍以上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定后，通過MASCOT、NCBI數(shù)據(jù)庫檢索和Uniprot蛋白質(zhì)功能和分類查詢，對差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行功能注釋和分類 (表2)。蛋白點(diǎn)A53為Ⅰ型膠原蛋白 (Col1a1)、A76為肌球蛋白L鏈1或 3 (MYL1)、A82是肌球蛋白調(diào)節(jié)L鏈2 (MLRS、Mylpf)、B72是肌動蛋白 (Actb)，這4種蛋白質(zhì)與細(xì)胞骨架有關(guān)。蛋白點(diǎn)A45為丙酮酸激酶同工酶M1/M2 (KPYM，Pkm)、A47為6-磷酸果糖激酶(K6PF，Pfkm)，二者是能量代謝相關(guān)的酶。與細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激有關(guān)的差異蛋白有5種，分別為A12蛋白質(zhì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2 (Tgm2)、B84膜聯(lián)蛋白A5 (Annexin A5)、B99胞內(nèi)氯離子通道蛋白 1 (CLIC1)、B94谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶ω-1 (GSTO1) 和A23硫氧還蛋白域蛋白12 (Txndc12)。A74為脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 (NGAL)、A85為細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白1 (RABP1)、B125為視黃醇結(jié)合蛋白4 (RET4)，這3種蛋白與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。另外B38為白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑A (ILEUA，Serpinb1a)，參與炎癥免疫抑制。B106 為CT011蛋白未鑒定出來，其功能仍需進(jìn)一步研究。以上結(jié)果表明，氟中毒主要影響骨組織中細(xì)胞骨架的形成、能量代謝及細(xì)胞的應(yīng)激與凋亡，同時影響到物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及免疫抑制，而補(bǔ)充鈣可以緩解氟的骨骼毒性作用。

表2 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.4 顯著差異蛋白的生物信息學(xué)分析

2.4.1 GO注釋

將17種顯著差異蛋白提交至DAVID分析系統(tǒng)，得到差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO條目。按蛋白的富集度進(jìn)行排序，排名前6位的生物過程中依次有內(nèi)穩(wěn)定過程 (13%)、解剖結(jié)構(gòu)的發(fā)展 (11%)、小分子代謝過程 (11%)、運(yùn)輸 (11%)、蛋白質(zhì)復(fù)合體組裝 (11%)、應(yīng)激反應(yīng) (圖6)；在細(xì)胞成分中依次是細(xì)胞質(zhì) (19%)、細(xì)胞外空隙 (13%)、蛋白質(zhì)復(fù)合體 (12%)、胞外區(qū) (10%)、細(xì)胞器 (10%)、細(xì)胞核 (8%)、細(xì)胞成分 (8%)、和細(xì)胞溶質(zhì) (8%) (圖7)；在分子功能中依次為離子結(jié)合 (41%)、脂質(zhì)結(jié)合 (11%)、酶結(jié)合 (11%)、結(jié)構(gòu)分子活性 (7%)、激酶活性 (7%)、氧化還原酶活性 (7%) (圖8)。結(jié)合差異蛋白質(zhì)譜鑒定的結(jié)果，表明氟中毒重點(diǎn)通過應(yīng)激反應(yīng)引起骨骼產(chǎn)生氧化應(yīng)激、破壞細(xì)胞骨架、引起骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而補(bǔ)充鈣對氟的骨骼毒性有顯著的緩解作用。

圖6 骨骼差異蛋白參與的生物過程

圖7 骨骼差異蛋白包含的細(xì)胞成分

圖8 骨骼差異蛋白包含的分子功能

2.4.2 差異蛋白的pathway分析

基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異蛋白基因進(jìn)行通路注釋，得到差異蛋白基因所參與的所有通路。篩選出差異蛋白所參與的38條與骨代謝相關(guān)的通路 (表3)。與骨代謝相關(guān)的38條通路所涉及到的9種差異蛋白分別為Col1a1、Mylpf、Actb、Pkm、Pfkm、Serpinb1a、Tgm2、Txndc12和Gsto1。有部分差異蛋白參與了多種通路的代謝，如Actb同時參與16條通路，Pkm和Pfkm分別參與了8條通路，Col1a1參與了骨代謝的3條通路。但也有部分差異蛋白只涉及一種骨代謝通路，如Tgm2、Txndc12和Gsto1。在本實驗中，Col1a1參與了黏著斑(Focal adhesion，F(xiàn)A )、PI3K-Akt信號通路和ECM-receptor interaction這3條通路，F(xiàn)A是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的主要連接方式，整合蛋白的集聚可以造成黏著斑激酶 (FAK) 的集合與磷酸化，由此激活整條PI3K/Akt信號通路，維持對細(xì)胞及ECM粘附能力，改變細(xì)胞骨架，阻止細(xì)胞凋亡[18]。氟中毒發(fā)生時，影響ECM的形成，導(dǎo)致細(xì)胞骨架發(fā)生改變，提示鈣可能通過這3條通路調(diào)節(jié)Col1a1緩解骨骼氟中毒。Pfkm參與了AMP-activatedproteinkinase (AMPK) 信號通路，同時調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量和代謝平衡，其激活后可以增加ATP的生成。在本實驗中，Pfkm在氟中毒中表達(dá)量增加，可能會激活A(yù)MPK通路，補(bǔ)鈣后通過抑制AMPK信號通路中Pfkm的表達(dá)緩解氟中毒使Pfkm的表達(dá)量降低。

表3 差異蛋白參與的KEGG pathways

2.4.3 差異蛋白交互作用分析

采用 STRING 10.5 檢索17種顯著差異蛋白質(zhì)相互作用并建立蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)圖 (圖9)，除去DDX3Y和CT011這2種孤立蛋白，顯示15種差異蛋白存在相互作用，可以形成網(wǎng)絡(luò)代謝圖。

3 討論

氟中毒作為全世界廣泛存在的一種地方病，主要表現(xiàn)為氟骨癥和氟斑牙。有文獻(xiàn)報道，氟可能是通過mTOR自噬通路、凋亡通路、PI3K/Akt通路、p38MAPK信號通路、Sema4D/Plexin-B1信號通路和刺猬(Hh) 信號通路等引起機(jī)體氟中毒[19-21]。研究報道，鈣作為氟的一種拮抗劑，可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體通路和Wnt信號通路等緩解氟中毒[7,22]。本實驗通過2-DE和MALDI-TOF MS篩選分析F及Ca對骨組織蛋白的差異表達(dá)。結(jié)合UniProt數(shù)據(jù)庫、GO注釋、KEGG pathway與STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，鑒定出17種差異蛋白，38條骨代謝信號通路，且對17種差異蛋白的功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)氟中毒及鈣對骨組織的作用機(jī)制可能與細(xì)胞骨架、能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、離子通道及細(xì)胞凋亡等有關(guān)。

骨組織由多種骨細(xì)胞和ECM構(gòu)成，研究表明氟可以影響軟骨和骨骼的膠原代謝[4,23]。Col1a1是ECM中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有調(diào)控膠原纖維形成、組織分化、損傷修復(fù)、為骨基質(zhì)提供礦化支架等多種功能[24]。Actb是一種高度保守的細(xì)胞骨架蛋白，參與多種代謝通路，也是細(xì)胞骨架重塑引起細(xì)胞分裂的關(guān)鍵[25]，所以在細(xì)胞分泌、吞噬、移動、胞質(zhì)流動和胞質(zhì)分離、神經(jīng)的形成和細(xì)胞凋亡等過程中起重要作用。Mylpf也是細(xì)胞骨架的組成成分，并參與細(xì)胞質(zhì)流動、細(xì)胞器運(yùn)動、物質(zhì)運(yùn)輸、有絲分裂、胞質(zhì)分裂等過程并為細(xì)胞的頂端生長等提供所需的力[26]。黏著斑 (FA) 可以保持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和正常功能的穩(wěn)定和發(fā)揮[27]，也可以連接細(xì)胞與ECM，而黏著斑激酶 (FAK) 的集合與磷酸化可以激活整條 PI3K/Akt 信號通路，維持對細(xì)胞及ECM粘附能力，阻止細(xì)胞凋亡[19]。在本研究中氟影響ECM的形成，導(dǎo)致細(xì)胞骨架發(fā)生改變，引起Col1a1和Mylpf上調(diào)、Actb表達(dá)量降低；加鈣后，細(xì)胞骨架得以修復(fù)，Col1a1和Mylpf表達(dá)量上升、Actb下調(diào)。有研究顯示，PI3K/Akt信號通路可改變破骨細(xì)胞的骨架、分化、游走和存活[20]，而氟化鈉可以通過P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對人成骨細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控[28]，與本研究的結(jié)果一致。提示鈣可能通過調(diào)節(jié)P13K/Akt通路中Col1a1、Mylpf及Actb的表達(dá)緩解骨骼氟中毒。

圖9 差異蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析

Tgm2可通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)、轉(zhuǎn)氨基和脫氨基等作用催化Ca2+依賴蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾[29-30]，參與機(jī)體傷口愈合、自身免疫性疾病、腫瘤生長和氧化應(yīng)激反應(yīng)等諸多病理反應(yīng)[31-32]，在炎癥病變組織和炎癥刺激下細(xì)胞中的Tgm2表達(dá)升高。另外Tgm2表達(dá)可以激活酪氨酸激酶FAK，活化抗凋亡信號通路如P13/AKT等，促進(jìn)細(xì)胞增殖[33]。在本實驗中，氟中毒導(dǎo)致Tgm2顯著上調(diào)，加鈣后Tgm2表達(dá)量顯著下降，這與PI3K-Akt信號通路中Tgm2表達(dá)激活酪氨酸激酶FAK的研究結(jié)果相一致[33]。提示鈣可能通過調(diào)控Tgm2激活P13/AKT等通路緩解氟中毒，具體機(jī)制需進(jìn)一步驗證。

GSTO1在谷胱甘肽循環(huán)中具有單甲基砷酸 (MMA5+) 還原酶、硫醇轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽依賴的脫氫抗壞血酸還原酶活性[34]。Board等[35]和Menon等[36]分別在小鼠抗輻射細(xì)胞內(nèi)和炎癥反應(yīng)、結(jié)腸炎和肥胖癥模型中發(fā)現(xiàn)GSTO1表達(dá)顯著升高，表明GSTO1在氧化應(yīng)激中有非常重要的作用。本課題組在前期體外研究沉默GSTO1基因后低劑量氟對成骨細(xì)胞自噬增強(qiáng)，凋亡減少[37]，與本實驗結(jié)果不一致，其原因可能是低劑量氟的刺激作用和高劑量氟的毒性作用正好相反，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Serpinb1a是由白細(xì)胞受到炎癥刺激而釋放出的一種保護(hù)性的抗炎免疫調(diào)節(jié)劑，參與了阿米巴病 (Amoebiasis) 的代謝途徑。有研究指出缺乏Serpinb1a (Sb1a-/-)的小鼠肺部感染的敏感性增加[38]。在本實驗中，Serpinb1a在氟組表達(dá)量顯著降低，加鈣后表達(dá)量有所上升。Ashida等發(fā)現(xiàn)前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)和前列腺癌的全基因組基因表達(dá)譜中Serpinb1a顯著下調(diào)[39]，這與本研究結(jié)果相一致。提示氟可能通過調(diào)節(jié)Serpinb1a引起感染，而鈣可以抑制Serpinb1a蛋白的表達(dá)減輕骨骼炎癥反應(yīng)從而緩解氟中毒。

綜上所述，17種差異蛋白參與不同的骨代謝信號通路，鈣可能通過這些途徑進(jìn)而緩解氟對骨組織細(xì)胞的損傷。由于目前的研究僅僅是蛋白質(zhì)組學(xué)初篩試驗，這些差異表達(dá)蛋白與其相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還需要進(jìn)一步深入研究。

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Separation and identification of differential protein in rat’s bone with fluorosis and calcium supplementation intervention

Jinming Wang1, Huimiao Xu1, Zipeng Yan1, Jiarong Yang1, Yaya Zhu1, Xiaofang Cheng2, and Jundong Wang1

1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801,Shanxi, China 2 College of Arts and Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801,Shanxi, China

In order to explore the mechanisms underlying the calcium alleviating fluorosis at protein level, we made an attempt to establish fluorosis and calcium supplementation rat models to isolate and identify bone differential proteins. The bone proteins of different groups were compared by two-dimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry (MALDI-TOF MS), and analyzed by gene ontology annotation, pathway enrichment and interaction networks. The 17 proteins were identified in the fluorosis group (F) and the fluorosis calcium supplement group (F+Ca), including type I collagen (Col1a1), actin (Actb), protein glutamine transferase 2 (Tgm2), compared with the control group (C). These differential proteins are enriched in 38 bone metabolic pathways such as focal adhesion, PI3K-Akt signaling pathway, and AMPK signaling pathway. And the functions of these proteins are mainly related to cytoskeleton, energy metabolism, substance transport, ion channel, and apoptosis. Therefore, it is speculated that calcium may alleviate the fluoride-induced bone damage by regulating the focal adhesion, PI3K-Akt, AMPK and other signaling pathway, but the specific mechanism needs further research.

fluorosis, calcium, bone tissue, two-dimensional electrophoresis (2-DE), differential expressed proteins

November 29, 2018;

March 4, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 31001089), National Science Foundation of Shanxi Province (No. 2014011027-3).

Jinming Wang. Tel: +86-354-6288335; E-mail: jm50408@163.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 31001089)，山西省自然科學(xué)基金 (No. 2014011027-3) 資助。

2019-03-20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190318.1314.003.html

10.13345/j.cjb.180497

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(本文責(zé)編 陳宏宇)