張建燁，管 勇，孔 峰，趙升田

山東大學(xué)第二醫(yī)院 1泌尿外科 2中心實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 2500333山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院泌尿外科，濟(jì)南 250012

慢性腎臟病所引起的終末期腎病已成為導(dǎo)致全球人口死亡的一個(gè)重要因素[1]，其主要治療措施包括透析和腎臟移植。由于長(zhǎng)期透析會(huì)產(chǎn)生多種嚴(yán)重并發(fā)癥，如心血管疾病、感染和骨病等，給患者及其家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]，因此腎臟移植是目前最為理想的替代治療方式。然而，腎源的短缺及腎臟移植后需要終身服用抗免疫排斥藥物嚴(yán)重限制了其廣泛應(yīng)用[3- 4]，利用干細(xì)胞進(jìn)行再生醫(yī)學(xué)的研究則為終末期腎病的治療帶來(lái)希望，其中，腎臟脫細(xì)胞支架結(jié)合干細(xì)胞的研究引起了廣泛關(guān)注。 2013年，Song等[5]首次采用脫細(xì)胞腎臟支架結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞共培養(yǎng)并進(jìn)行原位移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植腎臟能夠產(chǎn)生尿液，這是腎臟再生研究中一個(gè)里程碑式的進(jìn)步。目前更多學(xué)者更加傾向于應(yīng)用腎臟脫細(xì)胞支架結(jié)合干細(xì)胞進(jìn)行腎臟再生研究，因?yàn)楦杉?xì)胞可多向分化，具有良好的可塑性，在特定條件下能分化為特定的細(xì)胞類(lèi)型，因此，干細(xì)胞的引入使采用腎臟脫細(xì)胞支架實(shí)現(xiàn)腎臟再生的研究向前邁進(jìn)了一步。哺乳動(dòng)物腎臟的產(chǎn)生來(lái)源于間介中胚層，間介中胚層又分化為后腎間質(zhì)、輸尿管芽，之后分別分化為腎單位和集合管，故間介中胚層被認(rèn)為是腎臟發(fā)生的初始階段。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSC)具有分化的多向性，便于從患者自身組織獲取，容易培養(yǎng)并且具有成瘤性低的特點(diǎn)，目前研究已證實(shí)中胚層來(lái)源的脂肪干細(xì)胞可以向多個(gè)方向分化，并且可以跨越胚層向其他胚層分化[6- 7]。本研究擬通過(guò)誘導(dǎo)ADSC分化為間介中胚層樣細(xì)胞，然后與腎臟脫細(xì)胞支架共培養(yǎng)，以期構(gòu)建有部分腎臟結(jié)構(gòu)的組織工程腎臟，為慢性腎病的治療提供選擇。

材料和方法

材料健康雄性Wistar大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量約250 g，由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；動(dòng)物維護(hù)遵循全國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)和醫(yī)學(xué)會(huì)的指導(dǎo)原則，并經(jīng)山東大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)備案和審批[批準(zhǔn)號(hào)：KYLL- 2017 (GJ)A- 0011]。ADSC完全培養(yǎng)基(ADSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗+1%谷氨酰胺)(美國(guó)Cyagen公司)、ADSC成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(成骨分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+0.1 μmol/L地塞米松+50 μmol/L抗壞血酸+10 mmol/L β-磷酸甘油)(美國(guó)Cyagen公司)、ADSC成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(成脂分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1 μmol/L地塞米松+10 μmol/L胰島素+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L甲基黃嘌呤)(美國(guó)Cyagen公司)、ADSC成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(成軟骨分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+10 μg/L TGF-β3+0.1 μmol/L地塞米松+50 μmol/L維生素C+6.25 mg/L胰島素)(美國(guó)Cyagen公司)；糖原合成酶激酶3抑制劑(CHIR99021)(美國(guó)R&D公司)、成纖維生長(zhǎng)因子9(fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9)(美國(guó)R&D公司)、抗CD34流式抗體(美國(guó)Thermo公司)、抗CD45流式抗體(美國(guó)Thermo公司)、抗CD90 流式抗體(美國(guó)Thermo公司)、抗CD105流式抗體(美國(guó)Thermo公司)、抗鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(odd-skipped related 1，OSR1)抗體(英國(guó)Abcam公司)、抗配對(duì)盒基因- 2(paired-box 2，PAX2)抗體(英國(guó)Abcam公司)、抗E-鈣黏素(E-Cadherin，E-CAD)抗體(英國(guó)Abcam公司)、抗GATA結(jié)合蛋白- 3(GATA-binding protein，GATA3)抗體(英國(guó)Abcam公司)、抗Wilms腫瘤基因1(Wilms’tumor 1，WT1)抗體(英國(guó)Abcam公司)。WB電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)、WB轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)、WB顯影儀(美國(guó)ProteinSimple公司)、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

ADSC獲取采用10%水合氯醛麻醉Wistar大鼠，斜行剪開(kāi)腹股溝區(qū)皮膚，剪取1塊脂肪墊，使用PBS清洗，并置于培養(yǎng)皿中加入等體積的0.1%的Ⅰ型膠原酶，37 ℃旋轉(zhuǎn)消化1 h，至變?yōu)榘咨槊訝?，棄去沒(méi)有被消化的組織，將消化物置于離心機(jī)中1500 r/min(r=13 cm)離心10 min后棄去上清，用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸底部細(xì)胞團(tuán)，接種到培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每2 d更換培養(yǎng)基去除未貼壁的細(xì)胞和組織，每天在光鏡下觀察待細(xì)胞密度達(dá)培養(yǎng)瓶80%后進(jìn)行消化傳代，獲得ADSC。

ADSC的成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)及鑒定待ADSC細(xì)胞密度接近80%時(shí)更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3 d換液，21 d后進(jìn)行茜素紅染色，觀察分化情況。同樣方法采用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)ADSC，每3 d換液，誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行油紅O染色，觀察分化情況。采用成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)ADSC，每3 d換液，誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行阿利新藍(lán)染色，觀察成軟骨誘導(dǎo)情況。

ADSC流式鑒定采用0.25%胰酶消化ADSC細(xì)胞，待大部分細(xì)胞懸浮后以等量體積的培養(yǎng)基中和胰酶，將混合液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管內(nèi)1200 r/min(r=13 cm)離心5 min后棄上清液，加入PBS洗2次后將細(xì)胞分為6組，濃度均調(diào)整至1×106/ml，終體積為100 μl，按照說(shuō)明中稀釋比例每組中分別加入CD34、CD45、CD90、CD105流式抗體，并采用相同來(lái)源的免疫蛋白作為陰性對(duì)照。避光孵育30 min后再用PBS洗2次以洗除未結(jié)合抗體，重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)。

間介中胚層樣細(xì)胞的誘導(dǎo)待ADSC在培養(yǎng)皿中密度接近50%時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)采用Takasato誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞(induce pluripotent stem cells，iPSC)向間介中胚層分化的誘導(dǎo)方案開(kāi)啟誘導(dǎo)[8- 9]，于第0天、第2天加入8 μmol/L CHIR99021，于第4天、第6天加入200 ng/ml的FGF9進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)至第7天后收獲間介中胚層樣細(xì)胞，置于鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

間介中胚層樣細(xì)胞的免疫熒光鑒定將誘導(dǎo)7 d的ADSC細(xì)胞爬片棄去培養(yǎng)基，使用PBS沖洗3次后加入細(xì)胞固定液固定30 min，用PBS洗凈，加入Triton X- 100通透30 min，而后使用5%山羊血清封閉液封閉1 h，洗凈封閉液后分別加入OSR1和PAX2兩種間介中胚層特異性表面標(biāo)志物抗體4 ℃孵育過(guò)夜，第2天用PBS沖洗后加入一抗所對(duì)應(yīng)的熒光二抗，室溫孵育1 h后加入DAPI進(jìn)行核染，5 min后洗凈多余DAPI進(jìn)行封片處理，置于熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)以未誘導(dǎo)ADSC作為對(duì)照進(jìn)行染色觀察。

間介中胚層樣細(xì)胞的Western blot鑒定將誘導(dǎo)7 d后的ADSC消化后加入蛋白裂解液。每個(gè)樣品取10 μg 行 SDS-PAGE 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(OSR1和PAX2) 4 ℃孵育過(guò)夜，次日采用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育 1 h后用化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

腎臟脫細(xì)胞支架的獲取將Wistar大鼠取腹部正中切口，結(jié)扎腎動(dòng)脈分支以上的腹主動(dòng)脈后，離斷腎動(dòng)脈、腎靜脈和輸尿管獲取腎臟，并在腎動(dòng)脈和輸尿管插套管針，用蠕動(dòng)泵以500 μl/min流速由動(dòng)脈端灌注0.5%SDS進(jìn)行脫細(xì)胞處理，6 h后腎臟變?yōu)橥该鳂?，再以同樣流速灌注無(wú)菌PBS以沖洗SDS和細(xì)胞碎片。

腎臟脫細(xì)胞支架的再細(xì)胞化將誘導(dǎo)得到的間介中胚層樣細(xì)胞通過(guò)支架動(dòng)脈端和輸尿管端注入，同脫細(xì)胞支架進(jìn)行共培養(yǎng)，置于自制腎臟體外培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)灌注，保持37 ℃恒溫，并持續(xù)通氣進(jìn)行培養(yǎng)，10 d后獲得再細(xì)胞化的腎臟。

再細(xì)胞化的脫細(xì)胞腎臟支架鑒定對(duì)結(jié)合間介中胚層樣細(xì)胞的腎臟脫細(xì)胞支架進(jìn)行HE染色。將組織進(jìn)行包埋、切片，并給予脫蠟和復(fù)水處理。其后依次進(jìn)行蘇木素和伊紅染色，伊紅染色結(jié)束后再逆梯度酒精進(jìn)行脫水，最后進(jìn)行封片處理，置于顯微鏡下觀察，腎臟脫細(xì)胞支架HE染色方法同上。對(duì)再細(xì)胞化支架進(jìn)行免疫熒光鑒定，鑒定腎臟的足細(xì)胞標(biāo)志物WT1和腎小管標(biāo)志物GATA3及E-CAD的表達(dá)情況。

結(jié) 果

ADSC的鑒定傳至第4代的ADSC在光鏡下呈長(zhǎng)梭形(圖1A)，成骨誘導(dǎo)21 d后可見(jiàn)骨化結(jié)節(jié)形成(圖1B)，成脂誘導(dǎo)14 d后可見(jiàn)圓形脂滴形成(圖1C)，成軟骨誘導(dǎo)21 d后可見(jiàn)軟骨球形成(圖1D)。流式鑒定結(jié)果顯示，細(xì)胞表面標(biāo)志物中CD90和CD105表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為98.7%和98.3%；CD34和CD45表達(dá)陰性，陽(yáng)性率分別為2.5%和1.9%，以相同來(lái)源的免疫蛋白作為陰性對(duì)照進(jìn)行染色，陽(yáng)性率為1.1%(圖1E)。

將ADSC向間介中胚層樣細(xì)胞誘導(dǎo)后的形態(tài)觀察利用體外培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)添加不同生長(zhǎng)因子將ADSC向間介中胚層樣細(xì)胞誘導(dǎo)7 d，可以觀察到獲得的間介中胚層樣細(xì)胞形態(tài)較ADSC形態(tài)產(chǎn)生明顯變化，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)楸馄綐拥亩噙呅?圖2)。

間介中胚層樣細(xì)胞的熒光鑒定將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向間介中胚層樣細(xì)胞誘導(dǎo)，7 d后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行OSR1和PAX2兩個(gè)間介中胚層特異性表面標(biāo)志物的鑒定，結(jié)果顯示可以觀察到陽(yáng)性表達(dá)，以ADSC做陰性對(duì)照，可以觀察到上述兩個(gè)標(biāo)志物在ADSC中不表達(dá)(圖3)。

ADSC：脂肪干細(xì)胞

ADSC：adipose-derived stem cells

A. ADSC光鏡下形態(tài)；B.經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的茜素紅染色；C.成脂誘導(dǎo)后的油紅O染色；D.成軟骨誘導(dǎo)后的阿利新藍(lán)染色；E.流式檢測(cè)ADSC標(biāo)志物，CD90和CD105陽(yáng)性率分別為98.7%和98.3%，CD34和CD45陽(yáng)性率分別為2.5%和1.9%，相同來(lái)源的免疫蛋白作為陰性對(duì)照陽(yáng)性率為1.1%(以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上)

A.microscopic observation of ADSCs；B.alizarin red staining of ADSCs after osteogenic differentiation；C.oil red O staining of ADSCs after adipogenic differentiation；D.alcian blue staining of ADSCs after chondrogenic differentiation；E.surface marker analysis by flow cytometry：CD90 and CD105 were 98.7% and 98.3% and CD34 and CD45 were 2.5% and 1.9%，respectively

圖1ADSC的成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)及流式鑒定

Fig1Induction of ADSCs adipogenic，osteogenic，chondrogenic differentiation and identification of ADSCs by flow cytometry

IM：間介中胚層

IM：intermediate mesoderm

A.ADSC誘導(dǎo)為間介中胚層樣細(xì)胞分化前的細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形；B.誘導(dǎo)間介中胚層樣細(xì)胞分化7 d后的細(xì)胞形態(tài)為扁平樣多邊形(以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上)

A. ADSCs were spindle-shaped under microscope before induction；B. after induction of ADSCs into IM-like cells for 7 days，the cells became flat and polygonous (all these experiments repeated three times)

圖2誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為間介中胚層樣細(xì)胞

Fig2Induction of ADSCs differentiate into IM-like cells

OSR1：鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子；PAX2：配對(duì)盒基因- 2；DAPI：4’，6-二脒基- 2-苯基吲哚

OSR1：odd-skipped related 1；PAX2：paired-bax 2；DAPI：4’，6-diamidino- 2-phenylindole

A.將誘導(dǎo)后獲得的IM樣細(xì)胞進(jìn)行OSR1染色，可以觀察到陽(yáng)性表達(dá)，未誘導(dǎo)的ADSC為陰性表達(dá)；B.將IM樣細(xì)胞進(jìn)行PAX2染色，觀察到陽(yáng)性表達(dá)，未誘導(dǎo)ADSC為陰性表達(dá)(以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上)

A. after induction of ADSC into IM-like cells，immunofluorescence of OSR1 showed positive results，with non-induced ADSCs as negative control；B. after induction of ADSCs into IM-like cells，immunofluorescence of PAX2 showed positive results，with non-induced ADSC as negative control (all these experiments repeated three times)

圖3IM樣細(xì)胞的鑒定

Fig3Identification of IM-like cells

間介中胚層樣細(xì)胞的Western檢測(cè)將誘導(dǎo)7 d所獲得的間介中胚層樣細(xì)胞進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示，以小鼠9.5 d胚胎軀干尾部位置的組織作為陽(yáng)性對(duì)照，可以觀察到誘導(dǎo)7 d后OSR1和PAX2的陽(yáng)性表達(dá)，而誘導(dǎo)前的ADSC并沒(méi)有觀察到類(lèi)似現(xiàn)象(圖4)。

獲取腎臟脫細(xì)胞支架取出大鼠腎臟，于腎動(dòng)脈和輸尿管插入套管針，由腎動(dòng)脈灌注0.5%SDS，6 h后腎臟變?yōu)闊o(wú)色透明樣，對(duì)取得的腎臟和腎臟脫細(xì)胞支架進(jìn)行HE染色，可以觀察到腎臟脫細(xì)胞支架中已無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且保留了正常腎臟的整體結(jié)構(gòu)(圖5)。

間介中胚層樣細(xì)胞在脫細(xì)胞支架中的生長(zhǎng)情況將間介中胚層樣細(xì)胞從腎臟脫細(xì)胞支架的動(dòng)脈端和輸尿管端注入，結(jié)合支架共培養(yǎng)10 d后進(jìn)行組織切片，通過(guò)HE染色可以觀察到細(xì)胞在支架內(nèi)均勻分布于腎小球，腎小管等部位(圖6)。

間介中胚層樣細(xì)胞在支架中的分化情況鑒定對(duì)再細(xì)胞化的支架進(jìn)行免疫熒光鑒定，可以觀察到E-CAD、GATA3和WT1的陽(yáng)性表達(dá)(圖7)。

圖4Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)前后OSR1和PAX2的表達(dá)情況，可以觀察到誘導(dǎo)7 d后的細(xì)胞有陽(yáng)性表達(dá)，而未誘導(dǎo)的細(xì)胞無(wú)此現(xiàn)象，以小鼠胚胎9.5 d組織作為陽(yáng)性對(duì)照(以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上)

Fig4Western blot for the detection of the expressions of PAX2 and OSR1 in ADSCs and IM-like cells，with mouse embryos at day 9.5(E9.5) a positive control；PAX2 and OSR1 were not expressed in ADSCs but were highly expressed in E9.5 and IM-like cells induced from ADSCs (all these experiments repeated three times)

A.在大鼠腎臟腎動(dòng)脈和輸尿管插入留置針；B.經(jīng)過(guò)6 h SDS灌注沖洗后大鼠腎臟由紅色變?yōu)闊o(wú)色透明樣；C.HE染色觀察大鼠腎臟結(jié)構(gòu)；D.HE染色觀察腎臟脫細(xì)胞支架的結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)細(xì)胞成分(以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上)

A.harvesting of kidney with arterial and ureteral cannulae；B. after 6 h of perfusion with SDS，the kidney became transparent；C.HE staining of normal kidney；D.HE staining of decllularized scaffold(all these experiments repeated three times)

圖5脫細(xì)胞支架的制備與鑒定

Fig5Decellularization and identification of rat kidney scaffolds

A.細(xì)胞分布整體情況；B.腎小球內(nèi)的細(xì)胞分布；C.腎小管內(nèi)的細(xì)胞分布情況

A.HE staining shows the gross appearance；B.cell distribution in the glomerulus region；C. cell distribution in in tubules

圖6間介中胚層樣細(xì)胞對(duì)脫細(xì)胞支架進(jìn)行再細(xì)胞化

Fig6Recellularization of kidney scaffolds with IM-like cells

討 論

在終末期腎病的治療中，目前所采用的透析和腎臟移植并不能有效解決患者的疾病，透析可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并產(chǎn)生心血管疾病及骨病等并發(fā)癥[10]；腎臟移植受供體短缺的限制而不能廣泛應(yīng)用，且患者需終身服用抗免疫排斥藥物，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[11]。腎臟再生研究的發(fā)展為慢性腎臟病、終末期腎病的治療提供了一種新的策略。由于腎臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包括至少26種細(xì)胞[12]，所以需要一種整體腎臟再生的方法。腎臟脫細(xì)胞支架具有正常腎臟結(jié)構(gòu)，保留了細(xì)胞外因子，將脫細(xì)胞支架結(jié)合干細(xì)胞，可利用支架的微環(huán)境和細(xì)胞外基質(zhì)所保留因子的作用誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化，產(chǎn)生腎臟結(jié)構(gòu)，通過(guò)體內(nèi)移植實(shí)現(xiàn)有結(jié)構(gòu)和有功能的再生腎臟。

ADSC具有多向分化潛能并且成瘤性較低。經(jīng)ADSC誘導(dǎo)的間介中胚層樣細(xì)胞比胚胎干細(xì)胞和iPSC誘導(dǎo)所得細(xì)胞更加穩(wěn)定。與其他干細(xì)胞相比，ADSC具有來(lái)源豐富、易培養(yǎng)、無(wú)免疫排斥、增殖速度快、能夠跨胚層多向分化等優(yōu)點(diǎn)。ADSC由中胚層分化而來(lái)，在特定的生長(zhǎng)因子和環(huán)境誘導(dǎo)下可以向不同的細(xì)胞系分化，已經(jīng)確認(rèn)可以經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)成骨[13]、成脂[7]和成軟骨分化[6]，也可以分化為內(nèi)胚層來(lái)源的肝細(xì)胞[14]、胰島β樣細(xì)胞[15]及外胚層來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞[16]、心肌細(xì)胞[17]和上皮細(xì)胞[18]等。本研究則成功地在體外環(huán)境下將ADSC誘導(dǎo)分化為間介中胚層樣細(xì)胞。因體外誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞未能完全模擬體內(nèi)發(fā)育的間介中胚層而得到全部腎臟細(xì)胞類(lèi)型，為將其與體內(nèi)發(fā)育產(chǎn)生的間介中胚層細(xì)胞加以區(qū)分，本研究將體外誘導(dǎo)的細(xì)胞命名為間介中胚層樣細(xì)胞，表示可以表達(dá)間介中胚層細(xì)胞的表面標(biāo)志物OSR1和PAX2，并能經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)進(jìn)一步分化為腎系細(xì)胞類(lèi)型，但不能完全實(shí)現(xiàn)體內(nèi)發(fā)育階段的間介中胚層生物特性的一類(lèi)細(xì)胞。

E-CAD：E-鈣黏素；GATA3：GATA結(jié)合蛋白- 3；WT1：Wilms腫瘤基因- 1

E-CAD：E-cadherin；GATA3：GATA binding protein- 3；WT1：Wilms’tumor- 1

A.腎小管區(qū)域可見(jiàn)E-CAD陽(yáng)性表達(dá)；B. 足細(xì)胞區(qū)域可見(jiàn)WT1陽(yáng)性表達(dá)；C.腎小管區(qū)域可見(jiàn)GATA3陽(yáng)性表達(dá)；D.GATA3與E-CAD共染；E.GATA3與WT1共染(以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上)

A. expression of E-CAD in tubules；B. expression of WT1 in podocytes region；C. expression of GATA3 in tubules；D. expressions of GATA3 and E-CAD；E. expressions of GATA3 and WT1 (all these experiments repeated three times)

圖7免疫熒光鑒定再細(xì)胞化腎臟

Fig7Identification of recellularized kidney by immunofluorescence

本研究對(duì)誘導(dǎo)所得的間介中胚層樣細(xì)胞進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步確定所誘導(dǎo)的細(xì)胞能夠表達(dá)間介中胚層細(xì)胞標(biāo)志物，隨后將其作為種子細(xì)胞結(jié)合腎臟脫細(xì)胞支架用于腎臟再生研究。將間介中胚層樣細(xì)胞和支架共培養(yǎng)10 d后可以觀察到細(xì)胞黏附現(xiàn)象，免疫熒光鑒定可以發(fā)現(xiàn)間介中胚層樣細(xì)胞結(jié)合支架可以產(chǎn)生腎小管樣和足細(xì)胞樣的分化，證明經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的干細(xì)胞結(jié)合脫細(xì)胞支架后可以進(jìn)一步分化，而在先前的研究中直接利用干細(xì)胞結(jié)合支架并不能觀察到分化的情況，可見(jiàn)脫細(xì)胞支架具有誘導(dǎo)處于特定細(xì)胞階段的干細(xì)胞分化的能力，可作為一種理想的生物材料用于腎臟再生研究。

以往研究顯示，將干細(xì)胞結(jié)合脫細(xì)胞支架進(jìn)行共培養(yǎng)后可以觀察到干細(xì)胞在支架中貼附，但不能產(chǎn)生腎臟祖細(xì)胞或表達(dá)腎臟特有的標(biāo)志物[19]。本研究則可觀察到腎小管和足細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，這是實(shí)現(xiàn)腎臟再生研究向前邁進(jìn)的一步。目前，基于腎臟再生的研究主要集中在以下5種技術(shù)的應(yīng)用：脫細(xì)胞支架[20]、囊胚互補(bǔ)[21]、后腎移植[22]、腎臟類(lèi)器官[8]和生物人工腎[23]。其中，腎臟脫細(xì)胞支架結(jié)合干細(xì)胞是一種較為理想的腎臟再生方式。研究表明，腎臟脫細(xì)胞支架保持了原先腎臟的正常三維結(jié)構(gòu)，并且支架內(nèi)的細(xì)胞因子在脫細(xì)胞前后沒(méi)有明顯變化，這些細(xì)胞因子的存在使干細(xì)胞在支架內(nèi)能夠定向分化[24]。但有研究顯示，單純的未經(jīng)誘導(dǎo)的干細(xì)胞在支架作用下并不能展現(xiàn)出良好的分化能力[25]，考慮可能由于干細(xì)胞的分化方向多樣，僅僅依靠支架內(nèi)細(xì)胞因子的含量不足以使單純未經(jīng)誘導(dǎo)的干細(xì)胞定性分化為某種特定的成體細(xì)胞。此外，不同分化階段的干細(xì)胞結(jié)合支架產(chǎn)生進(jìn)一步分化所涉及的信號(hào)通路可能不同，未誘導(dǎo)干細(xì)胞結(jié)合支架所涉及的信號(hào)通路可能與干細(xì)胞自身分化的信號(hào)通路產(chǎn)生沖突，因而在支架內(nèi)的干細(xì)胞不能展現(xiàn)出良好的定向分化能力。因此，本研究將干細(xì)胞首先誘導(dǎo)至間介中胚層樣細(xì)胞階段，再通過(guò)脫細(xì)胞支架的作用誘導(dǎo)間介中胚層樣細(xì)胞向腎系分化，結(jié)果也證實(shí)了該思路的可行性。

總之，國(guó)內(nèi)外研究所面臨的問(wèn)題是干細(xì)胞的貼附及分化效率不夠令人滿意，并且尚不能起到替代完整腎臟功能的作用，這也是我們今后研究的重點(diǎn)。一旦脫細(xì)胞支架技術(shù)能夠成功，將會(huì)為終末期腎病的治療提供新的選擇。