張曉靜，賀松坡，曹銀生

許昌市中心醫(yī)院耳鼻喉科，河南 許昌4610000

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，占頭頸部惡性腫瘤的3.3%～8.1%，以鱗狀細胞癌最常見[1]。目前喉癌的發(fā)生尚無確切病因，可能是多種因素共同作用導(dǎo)致，例如吸煙、空氣污染、職業(yè)因素以及病毒感染等[2]。喉癌的發(fā)生與多種癌基因和抑癌基因的表達、調(diào)控以及細胞凋亡有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，存活蛋白（survivin）、Ki-67在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有一定作用[4]。目前有關(guān)survivin、Ki-67在喉癌中作用機制的研究較少。本研究探討了survivin和Ki-67蛋白在喉癌患者中的表達情況及其與臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年3月至2017年4月許昌市中心醫(yī)院收治的喉癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未合并其他部位惡性腫瘤；②術(shù)后經(jīng)病理證實為喉癌；③均接受根治性切除手術(shù)；④術(shù)后生存期＞1個月，且未發(fā)生圍手術(shù)期并發(fā)癥；⑤具有術(shù)后病理組織標(biāo)本[喉癌組織和（或）癌旁組織]；⑥術(shù)前未接受放化療；⑦無高血壓、糖尿病、腎炎、急慢性盆腔炎及子宮內(nèi)膜異位癥等疾病，均未服用影響前列腺素和血栓素代謝的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)嚴重疾病者；②合并貧血及凝血功能障礙者；③合并風(fēng)濕及免疫系統(tǒng)疾病者；④合并嚴重的肝腎功能疾病者；⑤合并甲狀腺功能障礙者。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入120例喉癌患者。收集喉癌組織標(biāo)本120例及癌旁組織標(biāo)本50例，癌旁組織均經(jīng)病理證實為炎癥或正常黏膜。采集到喉癌組織的120例患者中，男68例，女52例；年齡32～73歲，平均年齡為（55.1±12.9）歲；分化程度：高分化58例，中低分化62例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例；TNM分期：Ⅰ期33例，Ⅱ期31例，Ⅲ期26例，Ⅳ期30例；采集到癌旁組織的50例患者中，男28例，女22例；年齡33～70歲，平均年齡（54.4±11.5）歲。兩組的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測標(biāo)本中survivin和Ki-67蛋白的表達情況。將切片脫蠟、水化處理，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法進行染色，使用3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫放置15 min。3%牛血清白蛋白封閉1 h，滴加1∶100兔抗人survivin多克隆抗體（購自美國SantaCruz公司）和鼠抗人Ki-67單克隆抗體（購自北京中山生物技術(shù)有限公司），4℃過夜。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次后，滴加生物素標(biāo)記的驢抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）工作液（購自武漢艾美捷科技有限公司），室溫孵育1 h，PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，孵育1 h。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色處理，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。切片經(jīng)過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。脫色后顯微鏡下觀察處理。陰性對照應(yīng)用PBS代替一抗進行染色，其他操作步驟相同。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

survivin陽性顆粒呈棕色，主要定位于細胞質(zhì)與細胞核；Ki-67陽性顆粒呈淺黃色或棕黃褐色，主要定位于細胞核。每張切片隨機選取10個高倍鏡（400倍）視野，每個視野計數(shù)100個細胞，對染色強度和陽性細胞比例進行評分[5]。染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞比例評分：＜25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分。將染色強度評分與陽性細胞比例評分相加，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。所有病理切片均由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進行評定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 survivin和Ki-67蛋白表達情況的比較

喉癌組織中survivin和Ki-67蛋白的陽性表達率分別為61.67%（74/120）和65.83%（79/120），分別明顯高于癌旁組織的14.00%（7/50）和16.00%（8/50），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=32.148、35.079，P＜0.01）。（表1、表2、圖1）

表1 喉癌組織和癌旁組織中survivin蛋白的表達情況

表2 喉癌組織和癌旁組織中Ki-67蛋白的表達情況

圖1 survivin和Ki-67蛋白在喉癌組織和癌旁組織中的表達情況（免疫組織化學(xué)染色，×200）

2.2 不同臨床特征的喉癌患者喉癌組織中survivin和Ki-67蛋白表達情況的比較

不同年齡、性別、分化程度的喉癌患者喉癌組織中survivin和Ki-67蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者喉癌組織中survivin蛋白的陽性表達率均明顯高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.897、7.689，P＜0.01）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者喉癌組織中Ki-67蛋白的陽性表達率均明顯高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.417、11.588，P＜0.01）。（表3）

表3 不同臨床特征的喉癌患者喉癌組織中survivin和Ki-67蛋白的陽性表達情況（n=120）

3 討論

喉癌的主要病理類型是喉鱗狀細胞癌。近年來隨著環(huán)境的變化，喉癌在中國的發(fā)病率呈上升趨勢，且男性發(fā)病率遠高于女性[6]。隨著喉癌手術(shù)治療和基因治療等技術(shù)的不斷進步，以及診斷和治療水平的不斷提高，中晚期喉癌的療效獲得提高，但患者的5年生存率仍不高[7]。尋找有效、特異的標(biāo)志物對于喉癌的診斷和治療具有重大意義。目前喉癌的發(fā)病機制尚不明確，其發(fā)生、發(fā)展可能是多基因損傷、多級因子相互作用的復(fù)雜過程，研究喉癌相關(guān)基因是揭示其發(fā)生、發(fā)展機制的重要基礎(chǔ)。腫瘤的發(fā)生不僅與細胞增殖有關(guān)，而且與細胞凋亡有關(guān)?；熣T發(fā)細胞凋亡的機制與凋亡調(diào)節(jié)密切相關(guān)。許多化療藥物通過活化白細胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶（interleukin-1β-converting enzyme，ICE）或相關(guān)蛋白酶而引發(fā)細胞凋亡[8]。探索抑癌基因的作用機制有助于實現(xiàn)對腫瘤的靶向治療。

survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，表達于腫瘤和胚胎組織。survivin與腫瘤細胞的分化、增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制蛋白，關(guān)于survivin抑制細胞凋亡的機制尚未完全闡明。研究表明，survivin的作用機制可能與其擾亂了正常的細胞周期有關(guān)[10]。survivin在正常組織中幾乎不表達，但在包括喉癌等多種腫瘤組織中高表達。金愛紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，survivin在卵巢癌組織中表達上調(diào)。胡慈浩等[5]研究證實，survivin在喉癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織及正常喉黏膜組織。本研究結(jié)果顯示，survivin在喉癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織（P＜0.01），與胡慈浩等[5]的研究結(jié)果一致，證實了喉癌的發(fā)生與survivin表達有關(guān)。

Ki-67是位于細胞核內(nèi)的一種非組蛋白，其表達與細胞分裂周期密切相關(guān)。Ki-67在細胞分裂的G1、S、G2和M期均表達，然而當(dāng)M期結(jié)束后，Ki-67就會很快降解。根據(jù)此特性，可以應(yīng)用相應(yīng)的抗體將細胞染色，從而判斷腫瘤細胞的活躍程度。Ki-67蛋白是反映細胞增殖程度的重要指標(biāo)。Ki-67與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，廣泛應(yīng)用于腫瘤檢測領(lǐng)域[12]。研究顯示，Ki-67在喉癌中的表達明顯升高[13]。本研究結(jié)果顯示，Ki-67在喉癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織（P＜0.01），與王菊香等[14]的研究結(jié)果一致。

腫瘤細胞的分化程度越低，其增殖活性越高，因此腫瘤細胞的多少與其分化程度密切相關(guān)。然而，survivin和Ki-67蛋白在喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機制尚不清楚。本研究分析survivin和Ki-67蛋白表達與喉癌患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌患者喉癌組織中survivin和Ki-67蛋白的陽性表達率均明顯高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.01），表明survivin和Ki-67蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，說明survivin和Ki-67蛋白在喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起到了重要的促進作用。

綜上所述，survivin和Ki-67蛋白在喉癌組織中高表達，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期關(guān)系密切。因此，深入研究survivin和Ki-67蛋白在喉癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機制，對于探索有效的腫瘤診治靶點、改善患者預(yù)后具有重要意義。