何笑凱，康鄭軍，柴蘊珠鄭州大學第五附屬醫(yī)院泌尿外科，鄭州455鄭州大學第一附屬醫(yī)院消化內科，鄭州45

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全部泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中位居首位[1]。據(jù)統(tǒng)計，膀胱癌的發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[2]。膀胱癌發(fā)病機制較為復雜，是多種基因、多種因素共同作用的結果，手術治療和手術后的輔助治療是目前治療膀胱癌的主要手段，但是仍然存在膀胱癌患者手術后高復發(fā)、高轉移的現(xiàn)象[3]。研究膀胱癌的發(fā)病機制對于膀胱癌的治療具有重要意義。叉頭框轉錄因子O3（forkhead box O3，F(xiàn)OXO3）是FOX家族的成員之一，能夠調控細胞核內的靶基因轉錄，參與細胞生物學功能的發(fā)揮[4]。FOXO3參與肝癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的生物學行為，與腫瘤患者的預后有關[5]。有研究表明，F(xiàn)OXO3能夠抑制胃癌、肝癌等腫瘤細胞的生長[6-7]。為了探討FOXO3對膀胱癌細胞生長的影響，本研究以膀胱癌細胞為研究對象，運用噻唑藍（methyl thiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）和細胞克隆形式實驗等生物學手段，探討FOXO3對膀胱癌細胞生長的影響，為靶向FOXO3治療膀胱癌提供理論參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌T24細胞購自中國科學院細胞庫；兔抗FOXO3多克隆抗體、兔抗β-鏈蛋白（β-catenin）多克隆抗體、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）多克隆抗體、兔抗磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）多克隆抗體均購自美國STANT公司；RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒購自美國Biomiga公司；FOXO3-pcDNA3.1和pcDNA3.1質粒由鄭州大學實驗室保存；FOXO3、GAPDH引物由美國Invitrogen公司合成；胎牛血清、青霉素、鏈霉素均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、DMEM、MTT均購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 膀胱癌細胞T24在10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素濃度均為100 U/ml的DMEM中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2飽和濕度，細胞濃度保持（2～6）×105/ml。所有實驗用細胞均為對數(shù)生長期細胞，培養(yǎng)至融合度為70%后，加入0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞轉染T24細胞以2×106/孔種植到6孔細胞培養(yǎng)板中，觀察細胞生長到占滿培養(yǎng)皿底部面積70%時，將培養(yǎng)液吸去。將FOXO3-pcDNA3.1、pcDNA3.1與DMEM混合后靜置5 min，與LipofectamineTM2000混合，在室溫條件下孵育20 min。取400 μl的上述混合液加入到6孔細胞培養(yǎng)板中，6 h后加入1 ml的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。將轉染FOXO3-pcDNA3.1和pcDNA3.1的T24細胞分別記為FOXO3組、Vector組，將沒有轉染的T24細胞記為對照組。

1.2.3 反轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction ，RT-PCR）檢 測FOXO 3 mRNA表達 對照組、Vector組、FOXO3組細胞轉染后培養(yǎng)24 h，用RNA提取試劑盒提取細胞中的RNA，反轉錄合成cDNA，RT-PCR檢測FOXO3 mRNA的表達。FOXO3正義序列：5'-AACCTTCTGATGTAAGTTAC-3'，反義序列：5'-GTGATTGCCTTCAGGATTAC-3'。GAPDH正義序列：5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，反義序列：5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。以 2-△△Ct法計算FOXO3 mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

1.2.4 蛋白質印跡（Westernblot）法檢測FOXO 3蛋白表達 對照組、Vector組、FOXO3組細胞轉染后培養(yǎng)24 h，倒掉培養(yǎng)液，加入冰預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，進行細胞裂解，4℃、12 000 r/min離心10 min，將上清液吸取至1.5 ml的EP管中。采用BCA法測定蛋白濃度。80 V電壓電泳4 h，觀察目的蛋白分子量的標記進入距離玻璃板底1 cm處。60 mA電流轉膜80 min。5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入1∶1000稀釋的一抗，4℃搖晃過夜，加入1∶2000稀釋的二抗，在室溫環(huán)境下孵育2 h。用ChemiDoc XRS+System曝光機曝光，用Image LabTM software掃描灰度值。以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值作為蛋白相對表達量。實驗重復3次，取均值。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖活力 對照組、Vector組、FOXO3組細胞用胰蛋白酶消化計數(shù)，使每100 μl的培養(yǎng)液中含有4000個細胞，種植到96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設置4個復孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl的MTT溶液進行處理，孵育4 h后，將培養(yǎng)板取出，棄上清，依次在每個孔中重新加入100 μl的二甲基亞砜溶液，振蕩反應5 min。觀察藍紫色的結晶溶解以后，酶標儀于570 nm的波長處測量光密度（optical density，OD）值。同時用 Western blot法檢測培養(yǎng)24 h后各組細胞中β-catenin、AKT、p-AKT蛋白表達水平，步驟同上。實驗重復3次，取均值。

1.2.6 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力 對照組、Vector組、FOXO3組細胞接種到6孔板中，密度為200/孔，每組設置3個復孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)14天后，待肉眼觀察形成細胞克隆后，停止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液吸除后，加入PBS洗滌兩次，用10 g/L的戊二醛固定，用5 g/L的結晶紫染色，用水沖洗幾次后，干燥，隨機選擇5個視野，置于顯微鏡下計數(shù)，含有10個以上的細胞記為1個克隆。實驗重復3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FOXO 3表達情況的比較

Vector組細胞中FOXO3 mRNA和蛋白相對表達量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；FOXO3組細胞中FOXO3 mRNA和蛋白相對表達量均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（圖1、表1）

圖1 Western blot法檢測對照組、Vector組、FOXO 3組細胞中FOXO 3蛋白表達情況

表1 對照組、Vector組、FOXO3組細胞中FOXO3 mRNA和蛋白相對表達量的比較±s）

表1 對照組、Vector組、FOXO3組細胞中FOXO3 mRNA和蛋白相對表達量的比較±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

FOXO3 mRNA 1.00±0.12 0.99±0.13 2.04±0.23*233.466 0.000 0.12±0.03 0.13±0.04 0.35±0.06*74.803 0.000對照組Vector組FOXO3組F值P值FOXO3蛋白組別

2.2 細胞增殖情況的比較

Vector組細胞OD值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；FOXO3組細胞OD值低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 對照組、Vector組、FOXO 3組細胞中OD值的比較± s）

表2 對照組、Vector組、FOXO 3組細胞中OD值的比較± s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

OD值0.89±0.04 0.88±0.07 0.56±0.05*211.400 0.000對照組Vector組FOXO3組F值P值組別

2.3 細胞克隆形成能力的比較

Vector組細胞克隆數(shù)目與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；FOXO3組細胞克隆數(shù)目低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 對照組、Vector組、FOXO 3組細胞克隆數(shù)目的比較±s）

表3 對照組、Vector組、FOXO 3組細胞克隆數(shù)目的比較±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

細胞克隆數(shù)目46.78±5.63 44.26±4.69 25.36±2.34*125.090 0.000對照組Vector組FOXO3組F值P值組別

2.4 β-catenin、AKT、p-AKT蛋白相對表達量的比較

Vector組細胞中β-catenin、p-AKT、AKT蛋白相對表達量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；FOXO3組細胞中AKT蛋白相對表達量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；FOXO3組細胞中β-catenin、p-AKT蛋白相對表達量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖2、表4）

圖2 Western blot法檢測對照組、Vector組、FOXO 3組細胞中 β-catenin、AKT、p-AKT蛋白表達情況

表4 對照組、Vector組、FOXO 3組細胞中 β-catenin、AKT、p-AKT蛋白相對表達量的比較（± s）

表4 對照組、Vector組、FOXO 3組細胞中 β-catenin、AKT、p-AKT蛋白相對表達量的比較（± s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

β-catenin 0.26±0.03 0.24±0.04 0.16±0.03*22.235 0.000 0.18±0.02 0.17±0.04 0.03±0.02*79.125 0.000 0.96±0.09 0.94±0.10 0.95±0.08 0.110 0.896對照組Vector組FOXO3組F值P值p-AKT AKT組別

3 討論

FOXO3是存在于細胞內的重要信號轉錄因子，參與調控細胞的生長、分化、代謝等過程[8]。FOXO3無論是在正常細胞還是在腫瘤細胞中均參與內環(huán)境穩(wěn)定、細胞生長等生物學過程，是細胞存活的長壽基因[9]。近年來的研究顯示，F(xiàn)OXO3在腫瘤發(fā)生、腫瘤血管生成、腫瘤細胞耐受、腫瘤代謝等方面發(fā)揮關鍵作用[10]。FOXO3含有FOX結構域，是目前研究最為完善的FOX家族成員[11]。FOXO3不僅可以通過與靶基因的結構域結合調控靶基因的轉錄，還可以通過影響細胞內多種信號轉導通路調控細胞的生長[12]。FOXO3在多種腫瘤中異常表達，并且與腫瘤的分期等有關[13]。梁超[14]的研究表明，F(xiàn)OXO3與肝細胞肝癌的生長、轉移等有關。Lu等[15]的研究顯示，S型雌馬酚可以通過作用于FOXO3影響前列腺癌細胞的生長、凋亡等生物學行為。

有研究表明，F(xiàn)OXO3能夠與細胞內多種信號通路的關鍵因子如β-catenin、AKT相互作用，形成多線條、立體的調控系統(tǒng)[16]。WNT信號通路是一個較為保守的信號通路，在線蟲或人體等多種動物體內均有表達，在細胞的生長、分化、遷移、凋亡等過程中具有十分重要的作用[17]。WNT異常與結腸癌、胃癌、膀胱癌等腫瘤的發(fā)生有關。β-catenin是WNT信號通路的關鍵蛋白，激活后其表達水平升高[18]。AKT信號通路參與細胞的生長，在人體內的多個組織和器官內發(fā)揮調控作用。AKT信號通路在腫瘤中過度活化，其磷酸化水平異常升高[19]。Luo等[20]的研究顯示，亞硒酸鈉可以通過作用于AKT/β-catenin/FOXO3誘導結腸癌細胞的凋亡。

本研究對體外膀胱癌細胞轉染了FOXO3過表達載體，RT-PCR和Western blot結果顯示FOXO3過表達載體能夠促進膀胱癌細胞中FOXO3 mRNA和蛋白的表達，成功構建了高表達FOXO3的膀胱癌細胞。MTT和細胞克隆形成實驗結果顯示，高表達FOXO3的膀胱癌細胞OD值下降，細胞克隆數(shù)目也減少，說明FOXO3抑制膀胱癌細胞生長。進一步通過Western blot法檢測β-catenin、p-AKT蛋白相對表達量發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3還能抑制膀胱癌細胞中β-catenin、p-AKT蛋白的相對表達量。這提示，F(xiàn)OXO3可能通過抑制β-catenin、p-AKT表達阻礙膀胱癌細胞生長。

綜上所述，F(xiàn)OXO3能夠在體外抑制膀胱癌細胞生長，這可能與FOXO3阻斷WNT信號通路和AKT信號通路有關，其具體的作用機制還需要進一步深入研究。本研究具有一定的局限性，對于FOXO3在其他多種膀胱癌細胞中的作用還需要后續(xù)實驗的驗證。本實驗結果為靶向FOXO3治療膀胱癌提供了依據(jù)，為研究FOXO3在腫瘤中的作用奠定了基礎。