陳 鑫，李芳蓉，張建軍，車樹理，安志剛，楊文璽

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)教學(xué)部，甘肅 定西 743000）

隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，飼料資源短缺問(wèn)題日漸突出，以致“人畜爭(zhēng)糧”，尤其是蛋白飼料的不足，嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-2]。因此，積極利用各種廢棄物開發(fā)新型的蛋白飼料資源是近年來(lái)飼料工業(yè)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，可變廢為寶，實(shí)現(xiàn)中藥渣的完全利用，在避免環(huán)境污染的同時(shí)，彌補(bǔ)了蛋白飼料短缺的現(xiàn)狀[3]。固態(tài)發(fā)酵相對(duì)于液體發(fā)酵，因其具有工藝簡(jiǎn)單，設(shè)備投資少，能耗低，產(chǎn)率高等特點(diǎn)，在蛋白飼料這種低附加值的產(chǎn)品生產(chǎn)中備受關(guān)注[3-5]。隨著世界各國(guó)對(duì)中醫(yī)的關(guān)注和對(duì)中藥的重視，給我國(guó)中醫(yī)藥事業(yè)的飛速發(fā)展提供了契機(jī)，加之市場(chǎng)對(duì)中藥產(chǎn)品研發(fā)力度的加大，隨之產(chǎn)生的中藥渣也越來(lái)越多，據(jù)相關(guān)資料表明，全國(guó)中藥渣的年排放量已達(dá)到6 000萬(wàn)～7 000萬(wàn)t[6-9]。中藥渣為中藥材經(jīng)提取有效成分后剩余的殘?jiān)?，含水量較高、極易腐敗，采用傳統(tǒng)的處置方式，如焚燒、填埋或固定區(qū)域堆放，勢(shì)必污染環(huán)境，同時(shí)造成資源的巨大浪費(fèi)[10-13]。因此，對(duì)中藥渣進(jìn)行合理利用是實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展的必由之路，是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的一個(gè)重要途徑[10，14]。

中藥渣中除了含有一定量的生物活性成分之外，還含有大量的粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、粗多糖、氨基酸、維生素及微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，仍具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[14-17]。通過(guò)固態(tài)發(fā)酵技術(shù)將中藥渣轉(zhuǎn)化為蛋白飼料，可實(shí)現(xiàn)藥用植物生物量的全利用，在消除環(huán)境污染、緩解蛋白飼料短缺的同時(shí)還能帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)效益，為中藥渣的資源化利用開辟了新途徑[6，18-19]。此外，這種新型飼料具有增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、調(diào)節(jié)代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)、提高產(chǎn)蛋率、降低飼料消耗和改善肉質(zhì)等保健功效，具有廣闊的應(yīng)用前景[20]。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)中藥渣制備蛋白飼料的研究報(bào)道很少。紅芪的根經(jīng)煎煮提取紅芪多糖后殘留的藥渣除了含有生物活性成分外，還含有大量的蛋白質(zhì)、纖維素、氨基酸及微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，可作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)一步開發(fā)利用。基于以上思路，本研究以紅芪藥渣為原料，利用白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）/產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）混合菌種對(duì)其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵的最佳工藝條件，為中藥渣發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）5.776、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）2.281：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心甘肅分中心。

1.1.2 中藥渣

試驗(yàn)所用中藥渣為隴西中天藥業(yè)生產(chǎn)紅芪口服液后殘留的藥渣，濕物料經(jīng)自然干燥、粉碎、過(guò)60目篩后置于干燥器中備用。本次試驗(yàn)所用藥渣主要成分含量：真蛋白9.47%、粗蛋白11.56%、粗纖維30.58%、還原糖2.63%。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，加熱溶解，pH自然，121℃濕熱滅菌30 min，用于白腐菌的培養(yǎng)。

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁1.0 L，瓊脂20.0 g，加熱溶解，pH自然，121℃濕熱滅菌30 min，用于產(chǎn)朊假絲酵母的培養(yǎng)。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：中藥渣20.0 g，水40.0 g，（NH4）2SO40.8 g，KH2PO40.1 g，K2HPO40.08 g，MgSO40.01 g，NaCl 0.01 g，CaCl20.02 g，放入250 mL三角瓶中，攪拌均勻，121℃濕熱滅菌30 min，用于固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)。

1.1.4 試劑

硫酸銅、硫酸鈉、硫酸銨、氫氧化鈉、氫氧化鉀、硫酸、硼酸、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸等（均為分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；T6S紫外可見分光光度計(jì)：普析通用儀器有限責(zé)任公司；QSY半自動(dòng)凱氏定氮儀：北京強(qiáng)盛分析儀器制造中心；GXP-9270型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：金壇市醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 固態(tài)發(fā)酵

將白腐菌、產(chǎn)朊假絲酵母分別在PDA培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基上活化3代后，制成一定濃度的菌懸液或孢子懸液（2×107個(gè)/mL），按一定比例接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間。除特別說(shuō)明外，發(fā)酵條件為裝料量50%，白腐菌與產(chǎn)朊假絲酵母的接種比1∶1[21-22]，接種量20%，發(fā)酵時(shí)間5 d，發(fā)酵溫度30℃。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物于70℃烘干，取樣測(cè)定真蛋白和粗纖維含量。

1.3.2 紅芪藥渣固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)，以發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白和粗纖維含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察（NH4）2SO4添加量（0、10 mg/g、20 mg/g、30 mg/g、40 mg/g、50 mg/g干藥渣）、裝料量（25%、50%、75%、100%）、水分含量（0.5 g/g、1.0 g/g、1.5 g/g、2.0 g/g、2.5 g/g、3.0 g/g干藥渣）、發(fā)酵時(shí)間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）對(duì)發(fā)酵效果的影響。

1.3.3 紅芪藥渣固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以（NH4）2SO4添加量（A）、裝料量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）3個(gè)因素為考察因素進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，以確定最佳工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 紅芪藥渣固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for solid-state fermentation conditions optimization of Radix hedysari residues

1.3.4 分析測(cè)定方法

（1）粗蛋白含量：采用國(guó)標(biāo)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[23]中的凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白含量。

（2）真蛋白含量：先用水洗滌去除樣品中可溶性氮源[24]，然后采用凱氏定氮法測(cè)定真蛋白含量，并計(jì)算出發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白增長(zhǎng)率，其計(jì)算公式如下：

（3）粗纖維含量：采用酸堿洗滌法[25]測(cè)定粗纖維含量，并計(jì)算出發(fā)酵產(chǎn)物的粗纖維降解率，其計(jì)算公式如下：

（4）還原糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸法[26]測(cè)定。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本次試驗(yàn)中，每個(gè)試驗(yàn)條件下做3個(gè)平行樣，結(jié)果為3個(gè)平行樣的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 （NH4）2SO4添加量對(duì)發(fā)酵效果的影響

氮是合成蛋白質(zhì)的重要元素，在微生物生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，紅芪藥渣中氮源相對(duì)缺乏，因此需要補(bǔ)充適量氮源。（NH4）2SO4添加量對(duì)發(fā)酵效果影響的試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 （NH4）2SO4添加量對(duì)發(fā)酵效果的影響Fig.1 Effect of（NH4）2SO4 addition on fermentation

由圖1可知，不同（NH4）2SO4的添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白和粗纖維含量的影響不同。在不添加（NH4）2SO4的情況下，發(fā)酵產(chǎn)物中的真蛋白含量由原來(lái)的9.47%提高至12.82%，粗纖維含量由原來(lái)的30.58%降低至26.57%，變化不大。適量地添加（NH4）2SO4有助于菌體蛋白和纖維素酶的合成，從而促進(jìn)纖維素的降解[3，19，21]。當(dāng)（NH4）2SO4添加量＜30 mg/g干藥渣之前，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量隨（NH4）2SO4的增加而上升，粗纖維含量隨（NH4）2SO4的增加而降低。當(dāng)（NH4）2SO4添加量為30 mg/g干藥渣時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量由原來(lái)的9.47%增加至18.56%，比原來(lái)提高了95.99%，粗纖維含量由原來(lái)的30.58%下降至21.78%，比原來(lái)降低了28.78%。當(dāng)（NH4）2SO4添加量＞30 mg/g干藥渣之后，真蛋白含量和粗纖維含量均有少量增加，這說(shuō)明此時(shí)菌體仍在生長(zhǎng)，使菌體蛋白含量繼續(xù)增加，而粗纖維的降解能力減弱?？赡艿脑蚴沁^(guò)多的（NH4）2SO4抑制了纖維素酶的合成或降低了纖維素酶的活性，進(jìn)而減弱了纖維素的降解能力。

2.1.2 裝料量對(duì)發(fā)酵效果的影響

適宜的裝料量有助于纖維素的降解和菌體蛋白的生成，因?yàn)檫m宜的裝料量有利于發(fā)酵過(guò)程中的氧氣和熱量的傳遞，進(jìn)而促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)代謝。裝料量過(guò)多或過(guò)少均不利于菌體的生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的生成率降低。裝料量對(duì)發(fā)酵效果的影響見圖2。

圖2 裝料量對(duì)發(fā)酵效果的影響Fig.2 Effect of material loading on fermentation

由圖2可知，當(dāng)裝料量＜50%之前，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量隨裝料量的增加而上升，粗纖維含量隨裝料量的增加而降低。當(dāng)裝料量為50%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量最高，為18.02%，比原來(lái)提高了90.28%，粗纖維含量最低，為20.62%，比原來(lái)降低了32.57%。當(dāng)裝料量＞50%之后，真蛋白含量逐漸下降，而粗纖維含量逐漸上升。故選擇最佳裝料量為50%。

2.1.3 水分含量對(duì)發(fā)酵效果的影響

固態(tài)發(fā)酵最大的特點(diǎn)是游離水較少。水是微生物生長(zhǎng)代謝必不可少的物質(zhì)，也是發(fā)酵的主要媒介物質(zhì)，因此，培養(yǎng)基中含水量的多少必然影響微生物的生長(zhǎng)及代謝能力。水分含量對(duì)發(fā)酵效果的影響見圖3。由圖3可知，在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，適宜的含水量可使藥渣顆粒具有良好的蓬松性，有利于微生物的生長(zhǎng)和酶的合成，從而增加菌體蛋白含量。水分添加量過(guò)多或過(guò)少均對(duì)菌體蛋白的合成產(chǎn)生不良影響?？赡艿脑?yàn)?，水分含量過(guò)少時(shí)，因水分不足，抑制了微生物的生長(zhǎng)代謝；水分含量過(guò)多時(shí)，藥渣容易產(chǎn)生粘黏現(xiàn)象，透氣性差，溶氧量少，也不利于微生物的生長(zhǎng)代謝。當(dāng)水分含量為2.0 g/g干藥渣時(shí)，菌體含量達(dá)到最大值，此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量也最高，為17.86%，增長(zhǎng)率為88.60%，粗纖維含量最低，為22.56%，降解率為26.23%。

圖3 水分含量對(duì)發(fā)酵效果的影響Fig.3 Effect of moisture content on fermentation

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響

適宜的發(fā)酵時(shí)間，可得到最大的蛋白產(chǎn)率和粗纖維降解率，同時(shí)可降低生產(chǎn)成本。因此，確定適宜的發(fā)酵時(shí)間對(duì)微生物發(fā)酵具有重要的指導(dǎo)意義。發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響見圖4。由圖4可知，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白增長(zhǎng)率和粗纖維降解率均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在第5天時(shí)達(dá)到最大值，真蛋白含量為18.72%，粗纖維含量為22.42%，此后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量下降而粗纖維含量上升。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，菌體不能充分利用碳源來(lái)生長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量較低，達(dá)不到發(fā)酵目的；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)酵環(huán)境已不利于菌體生長(zhǎng)，菌體易發(fā)生自溶，且易滋生雜菌，同時(shí)增加生產(chǎn)成本。故最佳發(fā)酵時(shí)間為5 d。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響Fig.4 Effect of fermentation time on fermentation

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由于水分含量對(duì)結(jié)果影響較小，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)（NH4）2SO4添加量、裝料量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)。由于飼料檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)真蛋白含量和粗纖維含量均有相關(guān)要求，因此，本試驗(yàn)采用雙指標(biāo)（真蛋白含量和粗纖維含量）分析方法對(duì)發(fā)酵效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)方法如下：發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量和粗纖維含量的基準(zhǔn)分別是15%和23%，真蛋白含量每上升0.1%則加1分，粗纖維含量每下降0.1%則加1分，以此類推。

綜合評(píng)分=（真蛋白含量-15%）/0.1%+（23%-粗纖維含量）/0.1%[12]。以發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量和粗纖維含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用雙指標(biāo)分析方法對(duì)發(fā)酵效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以確定最佳工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 紅芪藥渣固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for solid-state fermentation conditions optimization of Radix hedysari residues

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果可看出，3個(gè)因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響程度依次為（NH4）2SO4添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞裝料量，即（NH4）2SO4添加量對(duì)紅芪藥渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響最大，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含氮量的多少直接影響菌體蛋白和纖維素酶的合成，因此在生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制（NH4）2SO4添加量。3個(gè)因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量的影響均不顯著，可能的原因是試驗(yàn)誤差大且誤差自由度小（僅為2），使檢驗(yàn)的靈敏度降低，從而掩蓋了因素的顯著性；綜合正交試驗(yàn)極差分析與方差分析，得到白腐菌/產(chǎn)朊假絲酵母混合菌種固態(tài)發(fā)酵紅芪藥渣的最佳工藝條件為A2B2C2，由表中直觀分析可知，最佳發(fā)酵條件為A2B1C2，故對(duì)兩種發(fā)酵條件的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of verification experiments

經(jīng)測(cè)定A2B2C2組合的發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量為19.05%，粗纖維含量為19.94%，而A2B1C2組合的發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量為18.57%，粗纖維含量為22.24%，說(shuō)明A2B2C2組合發(fā)酵效果優(yōu)于A2B1C2。因此，最佳工藝條件為A2B2C2，即（NH4）2SO4添加量30 mg/g干藥渣，裝料量50%，發(fā)酵時(shí)間5 d。

3 結(jié)論

利用白腐菌/產(chǎn)朊假絲酵母混合菌種對(duì)紅芪藥渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以發(fā)酵產(chǎn)物中的真蛋白和粗纖維含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝，確定了最佳工藝條件為（NH4）2SO4添加量30 mg/g干藥渣、裝料量50%、水分含量2.0 g/g干藥渣、發(fā)酵時(shí)間5 d。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量達(dá)19.05%，粗纖維含量達(dá)19.94%。