唐賢華，田 偉，張崇軍，周 文，舒學(xué)香

（1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830；2.中國測試技術(shù)研究院，四川 成都 610021）

我國傳統(tǒng)白酒的釀造是依靠大曲中菌系的繁殖代謝而進(jìn)行的[1]。參與釀酒發(fā)酵的微生物種類很多，包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌等。追蹤其來源，主要是大曲發(fā)酵過程中網(wǎng)羅自然界的微生物，因而通過研究大曲中的微生物，了解大曲中微生物數(shù)量、種類和分布規(guī)律，從而明白白酒的發(fā)酵原理是很有必要的[2-5]。中溫大曲是清香型大曲酒的糖化發(fā)酵劑，由于其發(fā)酵最高品溫一般在50℃以下，故稱中溫大曲。

大曲的質(zhì)量與培養(yǎng)、貯存過程有著密切的關(guān)系，主要體現(xiàn)在微生物的差異上，不同時(shí)期曲坯的微生物結(jié)構(gòu)和數(shù)量有顯著區(qū)別，影響著糖化酶、液化酶和蛋白酶等多種酶類以及有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物的生成[6]。目前學(xué)者關(guān)于不同時(shí)期大曲研究中，蘇暢等[7]對不同時(shí)期大曲中分離的霉菌采用ITS4/5 rRNA區(qū)序列進(jìn)行分析比對，共分離鑒定了193株霉菌，分屬于13個(gè)種，初步探究出大曲生產(chǎn)過程中不同時(shí)期霉菌的組成和變化規(guī)律。張麗等[8]對醬香型大曲貯存過程中發(fā)酵性能變化進(jìn)行了研究，得到了高溫大曲的最佳貯存期，為穩(wěn)定基酒的產(chǎn)量和質(zhì)量提供了參考。王玉霞等[9]對濃香型白酒大曲在發(fā)酵和成熟過程中主要功能酶活力進(jìn)行了分析，為高產(chǎn)酶微生物的分離和篩選提供表征性指導(dǎo)作用，同時(shí)也為制曲工藝的改良和加強(qiáng)型特種大曲的研制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。而目前關(guān)于不同發(fā)酵和貯存期清香型大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)還有未有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)研究不同發(fā)酵期和貯存期中溫大曲微生物多樣性及其種群結(jié)構(gòu)。不但解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)和局限性，而且從未培養(yǎng)觀點(diǎn)出發(fā)全面系統(tǒng)地認(rèn)識了中溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)，克服了現(xiàn)有大曲未培養(yǎng)研究中在方法選擇、引物設(shè)計(jì)等方面的缺陷。同時(shí)也為基于培養(yǎng)方法的白酒功能微生物的深入開發(fā)及應(yīng)用提供了有效的參考。運(yùn)用PCR-DGGE方法研究不同發(fā)酵期和貯存期中溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，將其和大曲風(fēng)味組成分析、傳統(tǒng)的菌種分離鑒定等方法相結(jié)合，對鑒定和判斷大曲制曲過程中與大曲風(fēng)味物質(zhì)形成相關(guān)的主要微生物、指導(dǎo)大曲生產(chǎn)，具有非常重要的意義[10-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

中溫大曲樣品：取川南某酒廠制曲車間發(fā)酵期第0、2、4、6、8、10、12 天和貯存期第5、10、15、20天的中溫大曲，粉碎后使20目過篩率在90%以上，即為大曲樣品。

1.1.2 試劑

乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（分析純）、Triton X-100、引物P2和P3、NS1和GC-fung：生工生物工程（上海）股份有限公司；Goldview染料、十二烷基硫酸鈉（分析純）：上海賽百盛股份有限公司；氯化鈉（分析純）、去離子甲酰胺（分析純）、瓊脂糖、甲叉雙丙烯酰胺（分析純）、尿素（分析純）、冰乙酸（分析純）、Tris堿（分析純）：上海星火化工廠；SYBR Green熒光染料：美國Invitrogen公司；Plasmid Mini kit I：美國OMEGA BIo-Tek公司；PCR試劑：大連Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler型PCR儀、Dcode DGGE電泳儀：美國BIO-RAD公司；Bio-Best200E型凝膠成像分析系統(tǒng)：美國SIM公司；TY-80R型脫色搖床、JY-SP-C型水平電泳槽、DZF-6050B真空干燥箱、DK-S28電熱恒溫水浴鍋、TGL-16G臺式高速離心機(jī)：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；thermo 900超低溫冰箱：Thermo Scientific；SW-CG-1F型超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；Nano-200核酸濃度測定儀：通用（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲微生物總脫氧核糖核酸的提取和純化

（1）稱取5 g大曲樣品，加3 g石英砂充分研磨后裝入離心管中，加12 mL 2%十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）抽提液和200μL巰基乙醇，充分振蕩后65℃水浴約1 h。然后加入100μL蛋白酶k，振蕩5 min后放入搖床（37℃、210 r/min）繼續(xù)振蕩30 min。

（2）將離心管放入離心機(jī)中6 000 r/min、4℃條件下離心10 min，取上清液加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V）混合液充分振蕩，然后再12 000 r/min、4℃條件下離心10 min，再取上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V）混合液，充分振蕩后在相同條件下離心5 min，取上清液，重復(fù)兩次，加入0.6倍體積的異丙醇在-20℃沉淀1 h后12 000 r/min離心10 min，倒掉液體。得到的沉淀物用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗滌數(shù)次，將提取得到的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）吹干后加50μL Elution Buffer溶解，-80℃保存。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

（1）細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)PCR擴(kuò)增

引物為P2和P3。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，應(yīng)用降落PCR，65℃開始退火，每兩輪降低1℃，最終降至56℃，退火1 min；72℃延伸1 min；再94℃變性1 min；55℃退火1 min；72℃延伸1 min，共10個(gè)循環(huán)，72℃終延伸6 min。

（2）真菌18S rDNA基因PCR擴(kuò)增

引物為NS1[15]和GC-fung[16]。擴(kuò)增條件是95℃預(yù)變性4 min；93℃變性1 min，應(yīng)用降落PCR，55℃開始退火，每兩輪降低1℃，最終降至45℃；退火1 min；72℃延伸1 min；再94℃變性1 min；55℃退火1 min；72℃延伸1 min，共10個(gè)循環(huán)，72℃終延伸6 min，細(xì)菌、真菌PCR擴(kuò)增體系見表1，本研究所用引物見表2。

表1 PCR擴(kuò)增體系Table 1 System of PCR amplification

表2 本研究中用到的PCR引物Table 2 PCR primers used in this study

1.3.3 DGGE分析

（1）灌制變性梯度凝膠

配制40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺變性膠（37.5∶1）、50倍TAE緩沖液，配制好的試劑4℃保存。配制10%過硫酸銨分子溶液，于冰箱中4℃保存，溶液盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用。冼凈兩塊玻璃板，用電吹風(fēng)吹干，將塑料夾條夾放十兩塊玻璃板兩側(cè)對齊，并用長尾夾夾牢于灌膠架上加入無菌水驗(yàn)證，確保不漏水之后待用。制作聚丙稀酰胺凝膠的規(guī)格為20 cm×20 cm，厚1 mm，凝膠濃度為8%，變性范圍為30%～50%（100%的變性劑中含有去離子甲酰胺（40%）和尿素（7 mol/L））制備梯度膠，根據(jù)表3配制兩種變性濃度的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺溶液，配制好后將凝膠吸入兩個(gè)注射器中。

表3 變性梯度為30%～50%凝膠的配制[17]Table 3 Preparation of gel with denaturation gradient 30%-50%

（2）電泳分析[18]

在電泳槽里加入1×TAE緩沖液，打開加熱裝置預(yù)熱，使緩沖液的溫度達(dá)到60℃。取30μL PCR產(chǎn)物加5μL10×loadding buffer，混勻4℃保存。聚丙烯酰胺凝膠凝固好以后拔掉梳子，將長尾夾固定在電泳槽內(nèi)，將緩沖液的高度調(diào)節(jié)至剛剛超過加樣孔，用蛋白膠加樣針在加樣孔中加入35μL混勻后的PCR產(chǎn)物。蓋上電泳儀蓋，200 V電壓電泳3.5 h，電泳完后，用SYBR GreenⅠ染色45 min（在避光條件下每隔15 min染色1次），最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并取出拍照保存DGGE圖譜。

1.3.4 DGGE條帶的克隆測序[19]

將DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶標(biāo)記后，切膠回收并純化后連接到T載體并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選后，驗(yàn)證陽性克隆，最后送交測序公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，利用BLAST在GenBank（NCBI）核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列搜索，以比較代表菌株與已知相應(yīng)序列的相似程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 中溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 細(xì)菌16S rRNA的DGGE分析

中溫大曲細(xì)菌的16S rRNA[20]基因DGGE電泳圖見圖1，細(xì)菌DGGE圖譜的分析結(jié)果見表4，細(xì)菌16S rRNA基因的DGGE切膠條帶的測序結(jié)果分析見表5，細(xì)菌DGGE圖譜的豐度及條帶優(yōu)勢度見圖2。

從圖1和表4可以看出，共檢測到22條不同的條帶，這表明在清香型白酒大曲在制曲過程中存在有大量不同微生物菌株，說明大曲細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，且不同時(shí)期的大曲細(xì)菌組成存在明顯差異。

圖1 中溫大曲細(xì)菌的DGGE指紋圖譜Fig.1 DGGE fingerprint of bacteria in medium temperature Daqu

表4 中溫大曲細(xì)菌DGGE指紋圖譜的分析結(jié)果Table 4 Analysis results of DGGE fingerprint of bacteria in medium temperature Daqu%

從圖1和表4可知，發(fā)酵到第4天時(shí)，條帶8、9、10、11、12的亮度增加，說明這幾條條帶代表的細(xì)菌是大曲的優(yōu)勢菌群且數(shù)量增多，曲坯開始“穿衣”，品溫達(dá)到40℃以上，細(xì)菌的生長繁殖開始活躍起來，淀粉類物質(zhì)逐漸消耗，釋放大量的熱量，使曲塊和曲房的溫濕度迅速上升，同時(shí)抑制了不耐熱微生物的生長。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，第10天時(shí)細(xì)菌種類達(dá)到最大值，說明曲坯的細(xì)菌生長繁殖旺盛，微生物生長逐漸伸至曲塊內(nèi)部；分析原因是“大火”期間的高溫環(huán)境使得微生物的生長受到了抑制，以芽孢桿菌為代表的耐熱細(xì)菌數(shù)量增加，此過程微生物繁殖代謝仍十分旺盛。到貯存期，細(xì)菌種類數(shù)目開始明顯減少，由于淀粉的消耗使細(xì)菌的生長處于末期，但1、13、14、16、17、18、19和21號條帶亮度明顯，成為中溫大曲的主要細(xì)菌結(jié)構(gòu)，不同貯存期大曲的細(xì)菌結(jié)構(gòu)基本相同，數(shù)量上有所差異，這些細(xì)菌也是清香型大曲酒獨(dú)特風(fēng)味的重要來源。

2.1.2 中溫大曲細(xì)菌群落DGGE圖譜上條帶的序列分析

根據(jù)中溫大曲樣品的細(xì)菌PCR-DGEE指紋圖譜，將優(yōu)勢DGGE條帶切膠回收、克隆測序后，經(jīng)Blast比對，結(jié)果見表5。

表5 中溫大曲細(xì)菌群落DGGE圖譜條帶的序列分析Table 5 Sequence analysis of DGGE fingerprint band of bacteria in medium temperature Daqu

由表5可知，回收條帶DNA序列比對的同源性均在98%以上，結(jié)合DGGE圖譜可知，在制曲和制酒過程中細(xì)菌存在明顯的動態(tài)變化。在所測22個(gè)條帶中，其中未培養(yǎng)的細(xì)菌占較大的比重，說明大曲中還含有部分未知的細(xì)菌，其余細(xì)菌從屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），假單胞菌屬（Pseudomonas）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。芽孢桿菌包括解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和索氏芽孢桿菌（Bacillus sonorensis），魏斯氏菌包括類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）和高麗魏斯氏菌（Weissella koreensis），假單胞菌主要是以棲稻假單胞菌（Pseudomonas oryzihabitabs）為主，乳酸桿菌包括諾氏乳桿菌（Lactobacillus nodensis）、消化性乳酸桿菌（Lactobacillus alimentarius）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、乳酸乳球菌亞種（Lactococcus lactis subsp）以及香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）。其中以乳酸桿菌種類最多，芽孢桿菌次之。

圖2 不同發(fā)酵期和貯存期的中溫大曲細(xì)菌屬水平的豐度Fig.2 Abundance of bacterial in medium temperature Daqu in genus level in different fermentation and storage periods

由圖2可知，不同發(fā)酵期和貯存期中溫大曲細(xì)菌的組成基本相同，呈現(xiàn)動態(tài)變化的趨勢，未培養(yǎng)的細(xì)菌都占了較大部分；發(fā)酵前期大曲中Lactobacillus含量最多，其次是Bacillus，Weissella含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸增大；發(fā)酵中后期大曲中Bacillus所占的比例最大，其次是Lactobacillus，和培養(yǎng)條件的變化密切相關(guān)；貯存第5天時(shí)Weissella和Lactobacillus含量較低，后期逐漸增大，貯存后期大曲已培養(yǎng)的細(xì)菌中Lactobacillus、Bacillus和Weissell所占比例基本相同；貯存20 d后大曲中已培養(yǎng)的細(xì)菌中Bacillus和Lactobacillus含量最大，占據(jù)絕對優(yōu)勢。

2.2 中溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 真菌18S rRNA的DGGE分析

對大曲中真菌的18S rRNA基因DGGE電泳圖見圖3，真菌DGGE圖譜的分析結(jié)果見表6。

圖3 中溫大曲真菌的DGGE指紋圖譜Fig.3 DGGE fingerprint of fungiin medium temperature Daqu

表6 中溫大曲真菌DGGE圖譜的分析結(jié)果Table 6 Analysis results of DGGE fingerprint of fungiin medium temperature Daqu%

由圖3和表6可知，從不同發(fā)酵期和貯存期的中溫大曲樣品經(jīng)過DGGE電泳可以分離出18條電泳條帶，其中有6條是共有條帶，大曲樣品發(fā)酵開始時(shí)真菌數(shù)量較少，只有8號條帶亮度較大，隨著發(fā)酵的進(jìn)行到第10天，真菌的數(shù)量逐漸增大，種類增多，說明曲坯開始“上霉”，溫度逐漸升高。發(fā)酵后期由于溫度過高抑制了部分不耐熱真菌的生長，數(shù)量下降，適當(dāng)控制這一時(shí)期的發(fā)酵時(shí)間，可為大曲積累更多的代謝產(chǎn)物。貯存期大曲的真菌種類和數(shù)量變化趨勢基本一致，貯存第10天，部分真菌含量顯著增加，但后期有下降。整體的變化趨勢是剛開始發(fā)酵時(shí)真菌種類最多，貯存后期真菌數(shù)目逐漸減少。

2.2.2 中溫大曲真菌群落DGGE圖譜上條帶的序列分析

根據(jù)不同發(fā)酵期和貯存期中溫大曲樣品的真菌PCRDGGE指紋圖譜，將優(yōu)勢DGGE條帶切膠回收、克隆測序后，經(jīng)Blast比對，結(jié)果見表7，真菌DGGE圖譜的豐度及條帶優(yōu)勢度見圖4。

表7 中溫大曲真菌群落DGGE圖譜上條帶的序列分析Table 7 Sequence analysis of DGGE fingerprint band of fungiin medium temperature Daqu

從表7可以看出在共檢測到18條不同條帶，回收條帶DNA序列比對的同源性均在99%以上，真菌從屬于根霉菌屬（Rhizopus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、海洋酵母屬（Kodamaea）、維克霉菌屬（Wickerhamomyce）、黃絲曲霉屬（Talaromyces）、酵母菌屬（Saccharomycopsi）、淀粉霉菌屬（Amylomyce）和畢赤酵母屬（Pichia）。其中以霉菌的種類最多，酵母菌次之。

其中淀粉霉（Amylomyces rouxii）、米根霉（Rhizopus oryzae）是重要的液化、糖化菌株；扣囊復(fù)膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）廣泛分布于自然界中，能夠分泌α-淀粉酶、蛋白酶在內(nèi)的多種水解酶，異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）也具有提高乙酸乙酯產(chǎn)量、分泌β-葡萄糖苷酶的能力，從而使得酒體風(fēng)味更加協(xié)調(diào)、豐滿。

圖4 不同發(fā)酵期和貯存期的中溫大曲真菌屬水平的豐度Fig.4 Abundance of fungal in medium temperature Daqu in genus level in different fermentation and storage periods

由圖4可知，不同發(fā)酵期和貯存期的中溫大曲真菌中的根霉菌屬和酵母菌屬占據(jù)絕對優(yōu)勢。發(fā)酵前大曲中Accharomycopsi、Rhizopus和Pichia是優(yōu)勢菌，有少部分的Amylomyce、Kodamaea和Lichtheimia，主要來自原料和環(huán)境中；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行時(shí)，隨著培養(yǎng)條件的變化，Wickerhamomyce和Amylomyces大量繁殖，含量明顯增大，到發(fā)酵第8天時(shí)，大曲真菌種類顯著減少，只有Pichia、Rhizopus、Wickerhamomyce和Amylomyce后期逐漸增加。大曲貯存期間，酵母菌和霉菌數(shù)量比基本維持不變，各類真菌呈現(xiàn)動態(tài)變化的趨勢，酵母菌的數(shù)量略高于霉菌。

3 結(jié)論

利用PCR-DGGE技術(shù)對不同發(fā)酵期和貯存期的中溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，全面了解了中溫大曲中的微生物種類和微生物群落結(jié)構(gòu)，可以有效避免傳統(tǒng)培養(yǎng)方法固有局限，得到了大曲中細(xì)菌和真菌在不同時(shí)期的變化趨勢，從而達(dá)到優(yōu)化中溫大曲的發(fā)酵的貯存條件，豐富微生物的種類的目的。

從分析結(jié)果來看，DGGE條帶解析出的中溫大曲細(xì)菌有19種，細(xì)菌從屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），假單胞菌屬（Pseudomonas）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其中芽孢桿菌屬（Bacillus）和乳酸菌（Lactobacillus）屬于優(yōu)勢菌群；中溫大曲真菌有13種，從屬于根霉菌屬（Rhizopus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、海洋酵母屬（Kodamaea）、維克霉菌屬（Wickerhamomyce）、黃絲曲霉屬（Talaromyces）、酵母菌屬（Saccharomycopsi）、淀粉霉菌屬（Amylomyce）和畢赤酵母屬（Pichia），其中根霉屬（Rhizopus）、畢赤酵母屬（Pichia）和酵母屬（Saccharomyces）屬于優(yōu)勢菌群。不同的時(shí)期大曲微生物種類和數(shù)量呈動態(tài)變化的趨勢，受培養(yǎng)條件（特別是溫度）的影響較大，整體的趨勢是發(fā)酵開始時(shí)微生物數(shù)量較少，到了發(fā)酵中期（4～8 d），微生物數(shù)量達(dá)到頂點(diǎn)，大量細(xì)菌和真菌旺盛繁殖，代謝產(chǎn)物不斷積累，發(fā)酵后期由于培養(yǎng)環(huán)境的變化以及營養(yǎng)的消耗，微生物群落逐漸減少并趨于穩(wěn)定；貯存期內(nèi)，微生物的種類的趨于平穩(wěn)，數(shù)量變化較大。