孫嘉弟,甘 穎,梁 韜,王心怡,萬 浩,王 平

(浙江大學生物傳感器國家專業(yè)實驗室,生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室,生儀學院,杭州 310027)

水是人類生存必不可缺的資源,但近年來國內外各類水體的水質卻面臨各方面的考驗,重金屬汞污染就是主要威脅之一。汞以元素汞、無機汞和有機汞三種形式存在于自然水體環(huán)境中[1]。工業(yè)汞污染排放以無機汞為主[2],就算僅有少量汞離子進入到血液中,它也極容易與腎細胞的蛋白質牢固結合并具有抗原性,引起變態(tài)反應,使得腎功能遭受嚴重破壞而引起腎病綜合癥[3]。汞離子還能在微生物的轉化作用下轉變成有機汞,有機汞難降解,會在水生生物體內積蓄,通過食物鏈富集進入人體后將對健康造成嚴重損害。人體內多數功能性酶均為蛋白質,蛋白質由氨基酸通過巰基相連組成,而汞能與巰基形成穩(wěn)定的絡合物而使酶蛋白失活,且還能與羧基、氨基和磷?；@些功能性基團絡合而破壞其活性,進而阻礙細胞的生物活性及正常代謝,導致各種病變[4]。然而,汞及其化合物由于有很多特殊性能,已被大規(guī)模地應用到生產中,我國目前涉及汞的行業(yè)眾多,由此造成的污染范圍非常廣,且有逐步擴大的態(tài)勢,我國汞污染問題會在相當長一段時間內存在著[5]。因此,在環(huán)境和食品監(jiān)測領域,具有高靈敏度的汞離子檢測方法受到廣泛關注。

傳統(tǒng)的汞離子檢測手段有原子吸收光譜法(AAS)、原子發(fā)射光譜法(AES)及等離子體電感耦合質譜法(ICP-MS)等[6]。AAS的原子吸收帶寬很窄,雖然選擇性較強,但對樣品制作的要求較高,對復雜樣品的分析精密度較低,分析時間較長,對設備的要求也高,而且無法同時分析多種不同的元素[7];AES分析速度快、選擇性好,可同時分析多種元素,與其他方法的結合也受到廣泛關注,但所用設備昂貴,當元素的含量較高時,其分析誤差較大,而當元素為超微量級時,分析的靈敏度又不夠;ICP-MS[8]檢出限低,被公認為最強有力的痕量元素分析技術,其檢測范圍寬,靈敏度高,還可進行多元素分析,但是由于檢測過程中需要將樣品汽化,這就要求樣品熱敏性低,溶液中懸浮雜質要少,即對待測樣品的要求較高,更主要的是儀器造價昂貴,且不能進行即時檢測。這些傳統(tǒng)檢測手段所需儀器昂貴而笨重,而且樣品預處理過程繁瑣,并不適用于現場痕量檢測[9],而另一些新興的方法,如冠醚類汞離子傳感器[10]、表面增強拉曼光譜法及陽極溶出伏安法[11],雖然相對而言更經濟便捷,但也存在選擇性不高的缺點。

相比以上方法,電化學傳感器檢出限低,靈敏度高,操作簡便,且易于微型化,方便設計成便攜式儀器,是最適合用于現場快速檢測的傳感系統(tǒng),基于寡核苷酸構建的電化學傳感器還具有高度特異性,具有非常廣的應用前景。因此本文構建了一種基于T-Hg2+-T特異性結構的電化學寡核苷酸傳感器,利用循環(huán)伏安法(CV)及交流阻抗譜法(EIS)等電化學分析手段在實驗室環(huán)境下對溶液中的Hg2+濃度進行了定量檢測與分析,通過優(yōu)化固定方式、固定時間以及固定比例提高了其性能指標,成功檢測到痕量汞離子,為現場監(jiān)測痕量汞離子提供了一種新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

寡核苷酸鏈5′-S-S-(CH2)6-TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT-3′(T20-SH)購自南京金斯瑞生物科技有限公司。6-巰基-1-己醇(MCH)和三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)購自阿拉丁工業(yè)公司,TE緩沖液購自美國Sigma-aladin公司。汞離子標準液購自國家標準物質資源平臺。配溶液用水均為由Milli-Q純水系統(tǒng)制得的超純水(≥18.3 MΩ)。實驗所用儀器CHI660E電化學工作站購自上海辰華儀器有限公司,KQ3200DE數控超聲波清洗器購自昆山超聲儀器有限公司,ThermoFisher離心機購自上海百基生物科技有限公司。

圖1 電化學寡核苷酸傳感器檢測Hg2+示意圖

1.2 檢測原理及仿真模型

1.2.1 檢測原理

檢測原理如圖1所示。全T序列寡核苷酸鏈(Oligo)的5′端修飾巰基,可以通過Au-S鍵的共價鍵合作用自組裝到金電極表面。Oligo結構柔韌,容易彎曲,而且除了Au-S鍵外還可以通過Au-N鍵與金電極結合,堿基暴露在外側很容易吸附到金電極的表面,這種非特異性吸附使得單鏈不規(guī)則地平躺在金電極表面。經過MCH封閉后,MCH通過競爭Au-S鍵結合位點來消除非特異性吸附,這種小分子自組裝層保證Oligo能夠保持一致而穩(wěn)定的結構固定在金電極表面。當檢測到Hg2+時,Oligo中的胸腺嘧啶與Hg2+特異性結合后形成一種“發(fā)卡型”結構,這種構象上的改變增強了相鄰鏈間的空間位阻和庫侖力,導致電極表面部分Oligo的釋放[12]。金電極表面的Oligo形態(tài)和密度上的變化能夠引起雙電層電容和電子轉移阻抗的變化,而后者的變化量可以通過交流阻抗譜法來定量測定。樣品Hg2+濃度不同,Oligo形態(tài)和密度變化的程度不同,對應的電化學指標改變量也不同,由此來定量檢測溶液中的汞離子濃度。

1.2.2 仿真模型

對實際得到的Nyquist圖構建等效電路進行仿真。首先構建該電池的等效電路,如下圖2電路模型所示。已知圓弧是由RC元件并聯組成的,且圓弧直徑大小等于生成它的RC元件中電阻R的阻值。放大上述Nyquist圖的高頻部分,在實際圖線中大圓弧并非與橫軸直接相交得到表征溶液電阻RS的截距,而是在大圓弧之前還存在一個非常小的半圓弧,表明溶液除阻抗成分外還存在電容成份,因此在RS并聯C1。實際中擴散層每層的離子濃度都不同,不過每層的阻抗行為等效于RC元件的并聯,為簡化電路,這個RC元件的無窮集合就用Warburg阻抗W1表示,雙電層的阻抗行為就用RCT、W1和雙電層電容的并聯來等效。

圖2 仿真模型

1.3 方法與步驟

清洗工作電極:金電極作為自組裝膜的基底,其表面的清潔程度是Oligo自組裝膜形成與否、穩(wěn)定與否的關鍵。預處理中先將工作電極在Piranha溶液中浸泡30s,去除電極表面的有機物。然后在金屬電極專用拋光海綿上依次用1.0 μm,0.3 μm,0.05 μm的氧化鋁粉末研磨拋光,按“8”字形沿順、逆時針各研磨50圈。再進行超聲清洗,依次在無水乙醇和去離子水中超聲5 min。最后進行電化學清洗,將三電極系統(tǒng)浸沒到0.5 mol/L稀硫酸中,進行循環(huán)伏安(CV)掃描直至CV曲線達到穩(wěn)定且出現較好的金氧化還原峰。取出電極,先用超純水清洗再用氮氣吹干。

配制探針溶液:Oligo凍干粉先經12 000 r/min高速離心1 min再用TE緩沖液配成100 μmol/L的Oligo溶液,密閉后充分震蕩混勻。加TCEP斷開二硫鍵:分別取2 μL上述Oligo溶液及100 μmol/L MCH溶液至離心管,各自加入等量100 mmol/L的TCEP,充分震蕩后靜置30 min,防止Oligo及MCH中巰基氧化形成二硫鍵混合物。配制Oligo-MCH-TCEP混合液:取2 μL配好的MCH-TCEP加到Oligo-TCEP混合液中,用0.01 mol/L PBS稀釋,充分震蕩并混勻。

修飾及表征:將金電極表面浸沒到上述Oligo-MCH-TCEP混合液中,在4 ℃的冰箱中靜置8 h。固定完畢后取出金電極,先浸在TE緩沖液中靜置20 min,除去未固定上的Oligo。然后將三電極體系浸沒到16 mL 2 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)混合液中,掃描并記錄金電極經過表面修飾后的交流阻抗曲線。

檢測樣品:讓金電極表面完全浸沒在汞標準液中,在室溫下反應10 min,用PBS緩沖液清洗后,把三電極體系一起浸沒到16 mL 2 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)中,掃描并記錄交流阻抗曲線。單次檢測結束后取出金電極,用PBS緩沖液清洗后繼續(xù)與汞標準液反應,并逐次加大汞標準液濃度,檢測電化學阻抗的變化。另設一空白對照組。

1.4 優(yōu)化實驗

金電極表面Oligo修飾層的有序性、完整性和穩(wěn)定性不僅受到表面清潔度的影響,還與Oligo的固定方式、固定時間、與MCH的濃度比例等因素相關,為盡可能地提高傳感系統(tǒng)的性能指標,在保證金電極表面清潔度較理想的前提下,本研究進行了系列優(yōu)化實驗。

固定方式的優(yōu)化:根據Oligo固定跟MCH封閉這兩個步驟的前后順序,可把Oligo的固定方式分為預固定、共固定和后固定三種。預固定就是在金電極表面先自組裝上Oligo,然后加MCH進行封閉,用較強的Au-S鍵取代較弱的Au-N,消除非特異性結合;共固定是將金電極浸沒在Oligo和MCH的混合溶液中,讓兩者競爭Au-S結合位點,同時固定到金電極表面;后固定則是先進行MCH封閉,在金電極表面形成小分子自組裝層,再固定上Oligo,讓Oligo的Au-S鍵去取代MCH的Au-S鍵。通過閱讀文獻,研究均表明后固定的效果不理想,故本研究著重比較了預固定和共固定兩者的效果。

固定時間的優(yōu)化:設置了固定時間分別為4 h、8 h、12 h和16 h的四組對照實驗,均采用共固定方式以及1∶1的Oligo和MCH比例,同組PBS緩沖液先后測試8次,用交流阻抗法對金電極表面Oligo的固定量及穩(wěn)定性進行檢測分析。

固定比例的優(yōu)化:實驗中設置了三組對照,混合液中Oligo與MCH的濃度比依次為1∶1、1∶10、1∶100,并用交流阻抗法進行了檢測分析。

1.5 特異性實驗

為驗證構建的傳感器對Hg2+的選擇性,本研究還進行了特異性實驗,即在相同條件下用這一傳感器檢測其他重金屬離子,對比檢測效果。實驗中設置了七組對照,分別為等體積(100μL)的10 nmol/L Hg2+標準液、1 μmol/L Cu2+標準液、1 μmol/L Cd2+標準液、1 μmol/L Pb2+標準液、1 μmol/L Cr3+標準液、超純水、10 nmol/L Hg2+與1 μmol/L所有其余離子的混合液。

2 結果與討論

2.1 工作電極表征

如圖3所示,金電極上修飾了Oligo后,在CV圖中其電流明顯減小,在Nyquist圖中其電子轉移阻抗大大增加,這是因為Oligo雙螺旋骨架上的磷酸基團水解后帶負電,電極表面增加的負電荷阻礙了電子傳遞,也阻礙了[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-的擴散。而經過MCH封閉處理之后,金電極的電子轉移阻抗略有減小,這是因為帶有巰基的MCH能以Au-S鍵與金電極結合,且Au-S鍵的鍵能大于Au-N鍵,MCH可以取代與金電極非特異性結合的Oligo。此外,MCH小分子組裝層還可以使得Oligo豎立在金電極表面,修飾層更加有序規(guī)整,電子傳遞和陰離子的擴散相對容易一些。

圖3 金電極修飾前后的表征圖

2.2 優(yōu)化實驗

兩種固定方式下的阻抗值及其變化率如圖4(a),結果表明在相同條件下,采用共固定方式固定上的Oligo明顯多于預固定方式,且檢測完同濃度的汞標準液后,共固定和預固定的阻抗變化率分別為79%和88%,前者的變化更明顯。重復實驗得到了一致的結果。共固定方式效果更佳可能是因為固定過程中Oligo與MCH同時競爭金電極表面的結合位點能使自組裝膜更均勻。

圖4 優(yōu)化結果

如圖4(b),結合固定量和穩(wěn)定性來分析,固定4 h,雖然金電極表面的電子轉移阻抗在固定前后的變化量最大,看似固定量最高但是非常不穩(wěn)定,這可能是因為4 h內MCH小分子自組裝層還沒有形成穩(wěn)定,多數Oligo仍不規(guī)則地平躺在金電極表面,導致固定量“虛高”,且非特性結合并不穩(wěn)定,檢測時交流阻抗的波動較大。固定8 h后,金電極表面電子轉移阻抗的變化量較小,即修飾層較為穩(wěn)定,此時MCH小分子自組裝層達到穩(wěn)定狀態(tài)。固定時間為12 h,金電極表面電子轉移阻抗的變化量又有明顯下降,修飾層穩(wěn)定性也變差,這可能是隨著時間的加長,有部分Oligo自然地脫落下來。當固定時間再加長到16 h時,金電極表面電子轉移阻抗的變化量略有下降,而且修飾層達到了非常穩(wěn)定的狀態(tài),此時電極表面留下結合最為牢固的Oligo,很少再有脫落。固定時間為16 h,雖然修飾層的穩(wěn)定性最好,但是電極表面固定上的Oligo太少,能檢測的Hg2+濃度范圍非常有限。而固定時間為8 h,其固定量與穩(wěn)定性均較為可觀,因此綜合比較之下,選定最佳固定時間為8 h。

如圖4(c),將阻抗值歸一化后,建立阻抗變化率與汞離子濃度間的線性關系,發(fā)現阻抗變化率與汞離子濃度的對數值間呈線性。比較各固定比例之間的結果可以發(fā)現,當Oligo∶MCH=1∶1時,斜率最大,響應最靈敏。而當Oligo∶MCH=1∶100時,線性范圍、線性度及響應靈敏度均不理想,這可能是因為MCH濃度過高,過多地競爭到Au-S結合位點,導致金電極表面能固定上的Oligo太少。

2.3 特異性實驗

檢測前后阻抗變化率的對比結果如圖5所示,傳感器對10 nmol/L Hg2+標準液和對所有離子混合液的響應近乎一致,即對混合液的響應基本來自Hg2+,而對1 μmol/L其余金屬離子的響應與超純水的近乎一致,這一結果表明本研究構建的傳感器對Hg2+具有高度選擇性。

圖5 傳感器對10 nmol/L Hg2+標準液、1 μmol/L 干擾離子、超純水及混合液的響應結果

2.4 標準曲線

根據以上優(yōu)化實驗結果,以1∶1的Oligo和MCH濃度比在4 ℃環(huán)境下共固定8 h后構建出傳感器,然后用于檢測一系列濃度的汞標準液,繪制對應的Nyquist圖,并進行三次重復實驗。進行Randles電路仿真,計算每條圖線對應的電子轉移阻抗RCT,分析RCT與汞離子濃度之間的定量關系。仿真結果示意圖如圖6所示,可見利用采用的等效電路模型得到仿真結果與原圖線有較高的吻合度。

圖6 仿真結果

與不同濃度汞液反應后金電極的Nyquist圖如圖7(a)所示,曲線從a到g對應的汞液濃度依次為0.5 nmol/L,3 nmol/L,10 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L,500 nmol/L,2 μmol/L。結果表明當用所構建的這一傳感器去檢測一系列濃度的汞液時,RCT隨Hg2+濃度的增加依次減小。這是因為金電極表面Oligo與Hg2+特異性結合后形成一種“發(fā)卡型”結構,導致相鄰Oligo序列間的空間位阻和庫侖力增強,電極表面部分Oligo分子釋放,密度減小,電子傳遞更容易,RCT也因此減小,Hg2+濃度越高結合得越多,RCT減小越多。

對阻抗值進行歸一化處理,最小二乘法線性擬合后得到如圖7(b)所示阻抗變化率與濃度對數值之間的線性關系。本傳感器的線性范圍為0.5 nmol/L～500 nmol/L,檢出限為0.2 nmol/L,且具有較好的重復性。

(a)檢測一系列濃度梯度汞標準液的Nyquist圖,從a到g對應的汞液濃度依次為0.5 nmol/L,3 nmol/L,10 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L,500 nmol/L,2 μmol/L;(b)標準曲線擬合結果圖7 檢測結果圖

2.5 回收率檢測

為了評估所構建的這一傳感器的適用性和可靠性,我們對飲用水進行了檢測,飲用水本底背景檢測結果如表1所示,由于飲用水中汞含量極低,利用ICP-MS也無法測得,于是我們檢測了實際水樣加入不同濃度Hg2+后的回收率,結果如下表2所示,加標濃度為0.5 nmol/L、1 nmol/L和5 nmol/L,其回收率分別為92%、125%和97%。以上結果表明,我們所構建的這種傳感器用于檢測飲用水中的微量汞離子時有較為令人滿意的結果。

表1 飲用水加標前后的離子濃度ICP-MS測定結果

表2 飲用水加標后的Hg2+回收率

3 結論

本文構建了一種檢測痕量Hg2+的電化學寡核苷酸傳感器,通過對固定方式、固定時間以及固定比例三方面進行優(yōu)化,改善了傳感器的性能,利用最小二乘法線性擬合得到了RCT與Hg2+濃度對數值間呈線性相關,線性范圍為0.5 nmol/L～500 nmol/L,檢出限為0.2 nmol/L,特異性實驗也證明該傳感器對Hg2+具有極高的選擇性,且有較好的重復性。這一傳感器結合了寡核苷酸鏈生物傳感器的高度特異性及電化學分析技術的準確性、便捷性,無需繁復的雜交過程也無需標記電活性基團,減少了操作過程帶來的不明確性,避免了電活性基團所帶電荷影響反應效果,性能更加穩(wěn)定,同時起到了簡化操作、改善性能和節(jié)省成本的作用。

隨著納米電極日漸成熟,本研究有望通過納米電極來進一步降低檢出限。實際水樣中往往含有多種重金屬離子,這些重金屬離子都是對人體健康的巨大威脅,若能同時有效地檢測出多種重金屬離子,這將是對本項研究實用性的重大提升。此外,在不同形態(tài)的汞中,甲基汞毒性最強,但目前測定甲基汞含量的方法主要依賴于大型儀器分析技術,且要與一些樣品前處理與分離技術聯用,非常繁瑣復雜,往后隨著甲基汞離子(CH3Hg+)特異性的寡核苷酸鏈探針的出現與發(fā)展,更多的研究將致力于對不同汞形態(tài)的選擇性測定。