于廣鑫 曾婉嘉 魯鳳民

（北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系 北京 100191）

1 外泌體簡介與發(fā)現(xiàn)、發(fā)展歷程

外泌體是細(xì)胞外囊泡（extracelulav vesicle，EV）中最小的一種，直徑約為30～150 nm，由晚期內(nèi)體／多囊泡體（multivesicular body，MVB）與質(zhì)膜融合后釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。早在1983年，Clifford Harding［1］和Bin-Tao Pan［2］利用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體可視化的方法，分別在大鼠和綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中，觀察到這種經(jīng)由多囊泡內(nèi)體（也稱多囊泡體）與質(zhì)膜融合而釋放的小囊泡，隨后Rose M.Johnstone［3］將之稱為“外泌體”。外泌體一開始被認(rèn)為是細(xì)胞排泄細(xì)胞碎片和過時廢物的一種形式，直到1996年，Graqa Raposo［4］發(fā)現(xiàn)衍生自人和鼠B 淋巴細(xì)胞的外泌體可以誘導(dǎo)抗原特異性MHC Ⅱ類限制性T 細(xì)胞應(yīng)答，證實外泌體參與細(xì)胞的免疫過程。外泌體領(lǐng)域的一次重要突破在于發(fā)現(xiàn)外泌體可以攜帶 mRNAs、微小RNA（mircroRNAs，miRNAs）［5］和線粒體RNA［6］等核酸內(nèi)容物并在細(xì)胞間相互傳遞。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了外泌體領(lǐng)域的研究熱潮。2013年，美國科學(xué)家James E.Rothman 和Randy W.Schekman，德國科學(xué)家Thomas C.Südhof 因為發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部囊泡（包括外泌體）運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制而榮獲諾貝爾獎。

2 外泌體的產(chǎn)生及分泌

圖1 外泌體產(chǎn)生與分泌（參考自文獻(xiàn)［9，10，12］）

外泌體的產(chǎn)生需要經(jīng)歷以下過程：細(xì)胞外物質(zhì)被細(xì)胞膜包裹并向內(nèi)凹陷形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體在遷移和成熟過程中，內(nèi)體膜向內(nèi)凹陷并將胞質(zhì)中的細(xì)胞物質(zhì)包裹，形成攜帶核酸、蛋白質(zhì)和其他代謝物質(zhì)等內(nèi)容物的管腔內(nèi)囊泡（ILV），進(jìn)而轉(zhuǎn)化成內(nèi)含多囊泡的晚期內(nèi)體，也稱多囊泡體。內(nèi)體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（ESCRT）及其相關(guān)蛋白或輔助因子，例如腫瘤易感基因101 蛋白（TSG101）、液泡蛋白分選因子（Vsp4）和Alix 蛋白等在此過程發(fā)揮了重要作用［7-8］。此外，涉及脂質(zhì)、中性鞘磷脂酶、跨膜4 超家族成員9（TM4SF9）、熱休克蛋白（HSP）等非ESCRT 依賴的外泌體產(chǎn)生途徑也被相繼提出［9-10］。之后，MVB 與細(xì)胞膜融合，這些管腔內(nèi)囊泡釋放到細(xì)胞外環(huán)境中形成外泌體。Rab GTP酶家族成員，尤其是Rab27a 和Rab27b，調(diào)控了該過程的進(jìn)行［11］。隨后外泌體利用膜融合、內(nèi)吞，以及識別和結(jié)合細(xì)胞表面特異性受體，將內(nèi)容物遞送至靶細(xì)胞。

3 外泌體的生理病理功能

外泌體可由免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和干細(xì)胞等多種類型細(xì)胞分泌，同時具有不同的生理功能，例如抗原呈遞［13］、RNA 傳遞［14］及組織修復(fù)［15］等。作為細(xì)胞間重要的通訊工具，外泌體攜帶了豐富的生物活性物質(zhì)，例如DNA，mRNAs，miRNAs 和蛋白質(zhì)等。這些物質(zhì)在脂質(zhì)雙分子層的保護(hù)下，可以相對穩(wěn)定地存在于細(xì)胞外環(huán)境中，因此，其不僅能作用于鄰近的細(xì)胞，還可通過體液運(yùn)輸進(jìn)入遠(yuǎn)端的靶細(xì)胞，履行其作為生理和病理信號載體的功能［16］。有研究顯示，外泌體可以介導(dǎo)神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，從而調(diào)節(jié)軸突生長和突觸形成［17］。除了參與正常的生理活動，外泌體還與疾病進(jìn)展有關(guān)。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體不僅可以影響局部的腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)血管形成和腫瘤細(xì)胞增殖，還能經(jīng)長距離運(yùn)輸?shù)竭_(dá)遠(yuǎn)端，增強(qiáng)血管形成并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分化，形成適合腫瘤轉(zhuǎn)移定植的微環(huán)境［18］。此外，外泌體可以將腫瘤抗原呈遞給樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答［12］。但其也能誘導(dǎo)活化的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞凋亡、減少自然殺傷細(xì)胞增殖能力或促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞的分化，從而發(fā)揮免疫抑制作用［19］。

4 外泌體的未來應(yīng)用

外泌體可以攜帶核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。幾乎所有體液中都有外泌體的存在，包括唾液、母乳、血液、滑液、羊水、尿液、精子和卵泡液等［20］。不同疾病患者從細(xì)胞釋放到循環(huán)系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)中的外泌體，其所含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA 水平有明顯差別，這使得血液或尿液等來源的外泌體可以作為多種疾病的潛在診斷標(biāo)志物［21-22］。多項研究表明，從血清中分離的外泌體擁有作為胰腺癌［23］、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［24］、胃癌［25］、神經(jīng)系統(tǒng)疾病［26-27］等疾病診斷標(biāo)志物的潛力，而尿液中的外泌體已作為生物標(biāo)志物的材料來源，用于腎臟、泌尿系統(tǒng)及全身性疾病的診斷［21，28］。相對于組織樣本的難獲取和難重復(fù)性，利用外泌體來源的生物標(biāo)志物進(jìn)行疾病的檢測，是一種準(zhǔn)確、無創(chuàng)且成本效益更優(yōu)的診斷方法。

除用于疾病診斷外，良好的生物相容性、循環(huán)穩(wěn)定性、生物屏障滲透性、低毒性和低免疫原性，使得外泌體具有作為藥物載體的潛力。利用外泌體進(jìn)行基因編輯工具的遞送，也是科學(xué)家關(guān)注的熱點。例如在體外將過氧化氫酶加載到外泌體中，通過鼻腔給藥到達(dá)急性腦炎小鼠模型腦部，使神經(jīng)元存活數(shù)量提高3 倍［29］。Kim 等［30］通過電穿孔方法將CRISPR／Cas9 表達(dá)質(zhì)粒注入外泌體中，可有效遞送CRISPR／Cas9 系統(tǒng)，進(jìn)而實現(xiàn)對靶細(xì)胞的基因編輯，這一發(fā)現(xiàn)揭示了外泌體在遞送CRIPSR／Cas9系統(tǒng)中的潛在價值。與Kim 等的研究類似，Lin 等［31］將外泌體和脂質(zhì)體孵育，開發(fā)了一種外泌體-脂質(zhì)體雜合的類脂質(zhì)體，并成功通過這種雜合類脂質(zhì)體遞送CRISPR-Cas9 表達(dá)質(zhì)粒。此外，也有研究者通過在Cas9 蛋白上融合2 ～4 個NEDD4家族蛋白的WW 結(jié)構(gòu)域，使Cas9 蛋白能被選擇性地募集到抑制蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白1（arrestin domain containing protein 1，ARRDC1）介導(dǎo)的微泡［ARRDC1-mediated microvesicles（ARMMs）］上［32］，或者在供體細(xì)胞中過表達(dá)水泡性口炎病毒的糖蛋白

（glycoprotein of the vesicular stomatitis virus，VSVG），使細(xì)胞能夠產(chǎn)生攜帶gRNA 和Cas9 蛋白的囊泡［33］。這些外泌體遞送基因編輯系統(tǒng)的研究，均極大地推動了CRISPR-Cas9 應(yīng)用于臨床的進(jìn)程。相對于人工合成的納米載體而言，外泌體在結(jié)構(gòu)和組成上與細(xì)胞膜更相似，具有足夠時長的循環(huán)半衰期，并且可以穿透組織深處并逃避免疫系統(tǒng)的清除，是一種很有應(yīng)用前景的遞送工具。此外，通過人工修飾外泌體以增加其靶向性，是當(dāng)下外泌體遞送策略的研究重點之一。這種靶向性可以通過在親本細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)靶向配體和跨膜蛋白域的融合質(zhì)粒完成，也可以對外泌體表面進(jìn)行靶向抗體的涂覆［34-35］。

5 外泌體研究面臨的挑戰(zhàn)

盡管外泌體在疾病診斷及藥物遞送方面表現(xiàn)出了令人興奮的應(yīng)用前景，但仍有一些問題需要注意。首先，如何提升內(nèi)容物檢測的靈敏度和特異性，是外泌體作為生物標(biāo)志物必須跨越的障礙。其次，血漿和尿液里的外泌體來源于多種組織細(xì)胞，如何通過外泌體的特異性表型特征，對其來源細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以更好地解讀外泌體攜帶的信息仍需進(jìn)一步探索。此外，樣本中包含有很多與外泌體相似的組分，例如細(xì)胞碎片、其他細(xì)胞外囊泡等，隨著外泌體研究的發(fā)展，現(xiàn)有分離技術(shù)已經(jīng)不能滿足研究的需要，開發(fā)更為高效的外泌體分離技術(shù)，才能在外泌體領(lǐng)域進(jìn)行更深入的探索。最后，作為藥物靶向載體，優(yōu)化出更為高效的藥物加載方式，以及精確、無副作用的靶向裝置，是保證治療成功的關(guān)鍵所在。