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        外泌體研究進(jìn)展及未來的應(yīng)用與挑戰(zhàn)*

        2019-07-08 03:04:22于廣鑫曾婉嘉魯鳳民
        生物學(xué)通報 2019年8期
        關(guān)鍵詞:脂質(zhì)體外泌體靶向

        于廣鑫 曾婉嘉 魯鳳民

        (北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系 北京 100191)

        1 外泌體簡介與發(fā)現(xiàn)、發(fā)展歷程

        外泌體是細(xì)胞外囊泡(extracelulav vesicle,EV)中最小的一種,直徑約為30~150 nm,由晚期內(nèi)體/多囊泡體(multivesicular body,MVB)與質(zhì)膜融合后釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。早在1983年,Clifford Harding[1]和Bin-Tao Pan[2]利用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體可視化的方法,分別在大鼠和綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中,觀察到這種經(jīng)由多囊泡內(nèi)體(也稱多囊泡體)與質(zhì)膜融合而釋放的小囊泡,隨后Rose M.Johnstone[3]將之稱為“外泌體”。外泌體一開始被認(rèn)為是細(xì)胞排泄細(xì)胞碎片和過時廢物的一種形式,直到1996年,Graqa Raposo[4]發(fā)現(xiàn)衍生自人和鼠B 淋巴細(xì)胞的外泌體可以誘導(dǎo)抗原特異性MHC Ⅱ類限制性T 細(xì)胞應(yīng)答,證實外泌體參與細(xì)胞的免疫過程。外泌體領(lǐng)域的一次重要突破在于發(fā)現(xiàn)外泌體可以攜帶 mRNAs、微小RNA(mircroRNAs,miRNAs)[5]和線粒體RNA[6]等核酸內(nèi)容物并在細(xì)胞間相互傳遞。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了外泌體領(lǐng)域的研究熱潮。2013年,美國科學(xué)家James E.Rothman 和Randy W.Schekman,德國科學(xué)家Thomas C.Südhof 因為發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部囊泡(包括外泌體)運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制而榮獲諾貝爾獎。

        2 外泌體的產(chǎn)生及分泌

        圖1 外泌體產(chǎn)生與分泌(參考自文獻(xiàn)[9,10,12])

        外泌體的產(chǎn)生需要經(jīng)歷以下過程:細(xì)胞外物質(zhì)被細(xì)胞膜包裹并向內(nèi)凹陷形成早期內(nèi)體,早期內(nèi)體在遷移和成熟過程中,內(nèi)體膜向內(nèi)凹陷并將胞質(zhì)中的細(xì)胞物質(zhì)包裹,形成攜帶核酸、蛋白質(zhì)和其他代謝物質(zhì)等內(nèi)容物的管腔內(nèi)囊泡(ILV),進(jìn)而轉(zhuǎn)化成內(nèi)含多囊泡的晚期內(nèi)體,也稱多囊泡體。內(nèi)體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(ESCRT)及其相關(guān)蛋白或輔助因子,例如腫瘤易感基因101 蛋白(TSG101)、液泡蛋白分選因子(Vsp4)和Alix 蛋白等在此過程發(fā)揮了重要作用[7-8]。此外,涉及脂質(zhì)、中性鞘磷脂酶、跨膜4 超家族成員9(TM4SF9)、熱休克蛋白(HSP)等非ESCRT 依賴的外泌體產(chǎn)生途徑也被相繼提出[9-10]。之后,MVB 與細(xì)胞膜融合,這些管腔內(nèi)囊泡釋放到細(xì)胞外環(huán)境中形成外泌體。Rab GTP酶家族成員,尤其是Rab27a 和Rab27b,調(diào)控了該過程的進(jìn)行[11]。隨后外泌體利用膜融合、內(nèi)吞,以及識別和結(jié)合細(xì)胞表面特異性受體,將內(nèi)容物遞送至靶細(xì)胞。

        3 外泌體的生理病理功能

        外泌體可由免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和干細(xì)胞等多種類型細(xì)胞分泌,同時具有不同的生理功能,例如抗原呈遞[13]、RNA 傳遞[14]及組織修復(fù)[15]等。作為細(xì)胞間重要的通訊工具,外泌體攜帶了豐富的生物活性物質(zhì),例如DNA,mRNAs,miRNAs 和蛋白質(zhì)等。這些物質(zhì)在脂質(zhì)雙分子層的保護(hù)下,可以相對穩(wěn)定地存在于細(xì)胞外環(huán)境中,因此,其不僅能作用于鄰近的細(xì)胞,還可通過體液運(yùn)輸進(jìn)入遠(yuǎn)端的靶細(xì)胞,履行其作為生理和病理信號載體的功能[16]。有研究顯示,外泌體可以介導(dǎo)神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用,從而調(diào)節(jié)軸突生長和突觸形成[17]。除了參與正常的生理活動,外泌體還與疾病進(jìn)展有關(guān)。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體不僅可以影響局部的腫瘤微環(huán)境,促進(jìn)血管形成和腫瘤細(xì)胞增殖,還能經(jīng)長距離運(yùn)輸?shù)竭_(dá)遠(yuǎn)端,增強(qiáng)血管形成并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分化,形成適合腫瘤轉(zhuǎn)移定植的微環(huán)境[18]。此外,外泌體可以將腫瘤抗原呈遞給樹突狀細(xì)胞,誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[12]。但其也能誘導(dǎo)活化的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞凋亡、減少自然殺傷細(xì)胞增殖能力或促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞的分化,從而發(fā)揮免疫抑制作用[19]。

        4 外泌體的未來應(yīng)用

        外泌體可以攜帶核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。幾乎所有體液中都有外泌體的存在,包括唾液、母乳、血液、滑液、羊水、尿液、精子和卵泡液等[20]。不同疾病患者從細(xì)胞釋放到循環(huán)系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)中的外泌體,其所含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA 水平有明顯差別,這使得血液或尿液等來源的外泌體可以作為多種疾病的潛在診斷標(biāo)志物[21-22]。多項研究表明,從血清中分離的外泌體擁有作為胰腺癌[23]、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[24]、胃癌[25]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[26-27]等疾病診斷標(biāo)志物的潛力,而尿液中的外泌體已作為生物標(biāo)志物的材料來源,用于腎臟、泌尿系統(tǒng)及全身性疾病的診斷[21,28]。相對于組織樣本的難獲取和難重復(fù)性,利用外泌體來源的生物標(biāo)志物進(jìn)行疾病的檢測,是一種準(zhǔn)確、無創(chuàng)且成本效益更優(yōu)的診斷方法。

        除用于疾病診斷外,良好的生物相容性、循環(huán)穩(wěn)定性、生物屏障滲透性、低毒性和低免疫原性,使得外泌體具有作為藥物載體的潛力。利用外泌體進(jìn)行基因編輯工具的遞送,也是科學(xué)家關(guān)注的熱點。例如在體外將過氧化氫酶加載到外泌體中,通過鼻腔給藥到達(dá)急性腦炎小鼠模型腦部,使神經(jīng)元存活數(shù)量提高3 倍[29]。Kim 等[30]通過電穿孔方法將CRISPR/Cas9 表達(dá)質(zhì)粒注入外泌體中,可有效遞送CRISPR/Cas9 系統(tǒng),進(jìn)而實現(xiàn)對靶細(xì)胞的基因編輯,這一發(fā)現(xiàn)揭示了外泌體在遞送CRIPSR/Cas9系統(tǒng)中的潛在價值。與Kim 等的研究類似,Lin 等[31]將外泌體和脂質(zhì)體孵育,開發(fā)了一種外泌體-脂質(zhì)體雜合的類脂質(zhì)體,并成功通過這種雜合類脂質(zhì)體遞送CRISPR-Cas9 表達(dá)質(zhì)粒。此外,也有研究者通過在Cas9 蛋白上融合2 ~4 個NEDD4家族蛋白的WW 結(jié)構(gòu)域,使Cas9 蛋白能被選擇性地募集到抑制蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白1(arrestin domain containing protein 1,ARRDC1)介導(dǎo)的微泡[ARRDC1-mediated microvesicles(ARMMs)]上[32],或者在供體細(xì)胞中過表達(dá)水泡性口炎病毒的糖蛋白

        (glycoprotein of the vesicular stomatitis virus,VSVG),使細(xì)胞能夠產(chǎn)生攜帶gRNA 和Cas9 蛋白的囊泡[33]。這些外泌體遞送基因編輯系統(tǒng)的研究,均極大地推動了CRISPR-Cas9 應(yīng)用于臨床的進(jìn)程。相對于人工合成的納米載體而言,外泌體在結(jié)構(gòu)和組成上與細(xì)胞膜更相似,具有足夠時長的循環(huán)半衰期,并且可以穿透組織深處并逃避免疫系統(tǒng)的清除,是一種很有應(yīng)用前景的遞送工具。此外,通過人工修飾外泌體以增加其靶向性,是當(dāng)下外泌體遞送策略的研究重點之一。這種靶向性可以通過在親本細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)靶向配體和跨膜蛋白域的融合質(zhì)粒完成,也可以對外泌體表面進(jìn)行靶向抗體的涂覆[34-35]。

        5 外泌體研究面臨的挑戰(zhàn)

        盡管外泌體在疾病診斷及藥物遞送方面表現(xiàn)出了令人興奮的應(yīng)用前景,但仍有一些問題需要注意。首先,如何提升內(nèi)容物檢測的靈敏度和特異性,是外泌體作為生物標(biāo)志物必須跨越的障礙。其次,血漿和尿液里的外泌體來源于多種組織細(xì)胞,如何通過外泌體的特異性表型特征,對其來源細(xì)胞進(jìn)行鑒定,以更好地解讀外泌體攜帶的信息仍需進(jìn)一步探索。此外,樣本中包含有很多與外泌體相似的組分,例如細(xì)胞碎片、其他細(xì)胞外囊泡等,隨著外泌體研究的發(fā)展,現(xiàn)有分離技術(shù)已經(jīng)不能滿足研究的需要,開發(fā)更為高效的外泌體分離技術(shù),才能在外泌體領(lǐng)域進(jìn)行更深入的探索。最后,作為藥物靶向載體,優(yōu)化出更為高效的藥物加載方式,以及精確、無副作用的靶向裝置,是保證治療成功的關(guān)鍵所在。

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