陽 勇,蔣盛軍,董志超,何際嬋,符乃方

（1.重慶市中藥研究院，重慶市南岸區(qū)南山街道南山路34 號(hào)400065；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所,海南省儋州市兩院571737 ）

中草藥紅茶菌制劑是基于蔣盛軍博士提出的中草藥益生菌制劑理論，利用復(fù)合益生菌群紅茶菌發(fā)酵甘草、菊花和羅漢果提取液而成，它對(duì)于人體和動(dòng)物消化道和呼吸道疾病的治療和預(yù)防都有很好的效果，尤其是在人體塵肺病的治療和預(yù)防和動(dòng)物口蹄疫和豬高熱病的治療方面，成效顯著[1-3]。

定性和定量的檢測物質(zhì)的含量是確定中草藥配方功效的重要指標(biāo)。 為了定性和定量確定中草藥紅茶菌制劑中的中草藥成分，我們利用高效液相色譜法

檢測了中草藥紅茶菌制劑中所用中草藥甘草、菊花和羅漢果的主效成分。 甘草中的主效成分是甘草苷或甘草銨；菊花中的主效成分是綠原酸和3.5-O- 雙咖啡?；?； 羅漢果的主效成分是羅漢果皂苷。 所以，我們以甘草苷、甘草銨、綠原酸和3.5-O- 雙咖啡?；岷土_漢果皂苷為主要參考對(duì)照成分，通過高壓液相色譜法檢測包含上述中草藥提取液的中草藥紅茶菌制劑。

1 材料

1.1 儀器 DGU-20 型高效液相色譜 （HPLC）儀（包括SPD-M20A 型二極管陣列檢測器）、AUW220D 型十萬分之一電子天平 （日本島津公司）；KQ250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（鞏義市華儀器有限責(zé)任）；Anke TGL-160G 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑 中草藥紅茶菌制劑，由蔣盛軍博士制備和提供，每瓶400 毫升。 甘草苷、甘草酸銨、綠原酸、3.5-O- 雙咖啡?；帷⒘_漢果皂苷的分析純標(biāo)準(zhǔn)品全部購買自SIGMA 公司。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純；水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 液相色譜法定性檢測中草藥主效成分 對(duì)中草藥紅茶菌制劑中菊花、甘草、羅漢果三種藥食兩用藥材中主效的指標(biāo)性化成成分進(jìn)行了定性研究，主效包括綠原酸、甘草苷、3.5-O- 雙咖啡?；帷⒘_漢果皂苷、甘草酸銨。

(1) 樣品制備方法考察 中草藥紅茶菌制劑為水溶液，制劑中三種藥材用量較低，所測成分均較有一定的水溶性， 且有其他成分的存在，嚴(yán)重影響樣品的處理，不利于含量測定，難度較大。最終確定樣品的制備為液液萃取后樣品。 制備方法為：精密量取本品200ml，用正丁醇振搖提取4次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓⑥D(zhuǎn)移至10ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，濾過，即得供試品溶液。

(2) 色譜條件研究與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Welch Ultimate AQ-C18(250mmx4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇（A）- 磷酸鹽緩沖液（B，含0.02mol/l的磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調(diào)pH 值至3.0），梯度洗 脫 （0--25min,10.0% →25.0% A；25--28min,25.0%→75.0%A）； 流速：1.0ml/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量：10μl.

本研究依據(jù)《中國藥典》2015年版中菊花、甘草、羅漢果三種藥材的含量測定方法為依據(jù)進(jìn)行色譜條件考察，經(jīng)研究確定流動(dòng)相條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按上述梯度進(jìn)行洗脫。

(3) 檢測波長研究 測定各對(duì)照品的紫外吸收波長，根據(jù)不同對(duì)照品的最大吸收，選定不同的紫外檢測波長。 檢測結(jié)果如圖1- 圖5 所示。

圖1 綠原酸紫外吸收?qǐng)D

圖2 甘草苷紫外吸收?qǐng)D

圖3 3.5-O- 雙咖啡?；?

圖4 羅漢果皂苷紫外吸收?qǐng)D酸紫外吸收?qǐng)D

圖5 甘草酸銨紫外吸收?qǐng)D

(4)檢測圖譜

圖6 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖7 甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖8 3.5-O- 雙咖啡酰基奎酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖9 羅漢果皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖10 甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖11 混合對(duì)照品的液相色譜圖

圖12 樣品液相色譜圖（210nm）

圖13 對(duì)照品各峰紫外吸收

圖14 樣品各峰紫外吸收

結(jié)果表明：利用高效液相色譜法可以快速檢測到中草藥紅茶菌制劑中中草藥菊花、 甘草、羅漢果三中藥材中綠原酸、 甘草苷、3.5-O- 雙咖啡?；?、羅漢果皂苷、甘草酸銨等指標(biāo)性成分。

2.2 液相色譜法定量檢測中草藥主效成分

(1) 定量成分的確定 通過上述定性研究結(jié)果，結(jié)合本產(chǎn)品特征，確定綠原酸、3.5-O- 雙咖啡酰基奎酸為本產(chǎn)品定量測定指標(biāo)性成分。

(2) 波長的選擇 根據(jù)圖譜雜質(zhì)干擾情況及綠原酸、3.5-O- 雙咖啡?；嶙畲笞贤馕者x擇檢測波長為326nm。

圖15 樣品液相色譜圖（326nm）

(3) 液相色譜條件 在定性研究的基礎(chǔ)上確定液相條件為：

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫； 檢測波長為326nm。理論板數(shù)按3，5-0- 二咖啡?；鼘幩岱逵?jì)算應(yīng)不低于8000。

(4) 對(duì)照品及供試品溶液制備方法 對(duì)照品溶液制備方法： 取綠原酸對(duì)照品、3，5-0- 雙咖啡?；鼘幩釋?duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中， 加70%甲醇制成毎l(fā)ml 含綠原酸35μg，3，5-0- 二咖啡酰基奎寧酸80μg 的混合溶液，即得（10°C 以下保存）

供試品制備方法：精密量取本品200ml，用正丁醇振搖提取4 次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至10ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，濾過，即得供試品溶液。

(5)樣品含量測定結(jié)果

含量測定結(jié)果見下表1。

表1 樣品的綠原酸和3.5-O- 雙咖啡?；岷繙y定結(jié)果

3 結(jié)論和討論

3.1 結(jié)論

3.1.1 樣品溶液制備方法：精密量取本品200ml，用正丁醇振搖提取4 次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干， 殘?jiān)蛹状既芙猓?并轉(zhuǎn)移至10ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，濾過，即得供試品溶液。

3.1.2 甘草、菊花、羅漢果三種藥材在《中國藥典》2015年版藥典中共有6 種對(duì)照品進(jìn)行了含量測定，本研究共使用了其中的5 種，具體結(jié)果如下。

（1）經(jīng)過色譜條件建立，對(duì)照品中綠原酸、甘草苷、3.5-O- 雙咖啡酰基奎酸、羅漢果皂苷、甘草酸銨5 個(gè)色譜峰能夠有效的完全分離，且色譜峰峰型較好；

（2） 經(jīng)過對(duì)照品對(duì)比研究， 樣品中綠原酸、3.5-O- 雙咖啡?；醿蓚€(gè)峰可以作為含量測定用，甘草苷分離效果不好，且峰較小，羅漢果皂苷與甘草酸銨峰面積均較小，含量太低不適合含量測定用；

（3）本研究所建立的含量測定方法，能夠?qū)Ρ酒分芯G原酸、3.5-O- 雙咖啡?；徇M(jìn)行含量測定。

3.2 討論

高效液相色譜法是檢測中草藥中主效主效成分的有效方法[4]。 利用高效液相色譜法檢測中草藥紅茶菌制劑中中草藥甘草、菊花和羅漢果的主效成分，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于甘草苷、甘草酸銨、綠原酸、3.5-O- 雙咖啡?；岷土_漢果皂甙， 都可以快速定性檢測出來。 這說明高效液相色譜法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中草藥紅茶菌制劑中中草藥成分的快速定性檢測。 但是，在定量檢測方法，我們發(fā)現(xiàn)我們無法對(duì)甘草苷、甘草酸銨、羅漢果皂甙進(jìn)行定量檢測。 這可能的原因，我們推測有四個(gè)：

（1）在中草藥紅茶菌制劑中，中草藥作為一種添加成分，為了不影響益生菌的發(fā)酵，所以中草藥添加量比較少，一般每種中草藥的添加量控制在1-3g。

（2）其次，這些中草藥在熬煮提取過程中，僅有部分水溶性成分析出。

（3）在發(fā)酵過程中，這些中草藥主效成分被益生菌發(fā)酵降解成次生代謝產(chǎn)物或其他中間體。

（4）在發(fā)酵過程中，微生物發(fā)酵成分等其他成分嚴(yán)重影響樣品的處理，干擾檢測。

綜合上述四個(gè)原因，雖然高壓液相色譜是一種非常靈敏的檢測設(shè)備，但是對(duì)于中草藥的一些主效成分也是難以做到定量檢測。 不過，我們也發(fā)現(xiàn)菊花中的兩種主效成分綠原酸、3.5-O- 雙咖啡?；峥梢詫?shí)現(xiàn)定量檢測，這其中的原因可能是這兩種主效成分含量比較高，容易熬煮提取出來，最后在發(fā)酵中降解量比較少。 因此，我們可以對(duì)綠原酸、3.5-O- 雙咖啡?；釋?shí)現(xiàn)定量檢測。