柯比倫?譚嗣偉?易家志?劉慧玲?江潔?吳斌

【摘要】目的 探討丁酸鈉對(duì)肝臟細(xì)胞代謝保護(hù)作用機(jī)制以及其與線(xiàn)粒體功能的關(guān)系。方法 采用1c1c7肝細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)線(xiàn)粒體及脂肪氧化相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因、蛋白表達(dá)以及三磷酸腺苷（ATP）生成。首先使用棕櫚酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)檢測(cè)線(xiàn)粒體相關(guān)基因;其后使用棕櫚酸+丁酸鈉共培養(yǎng)細(xì)胞并將其對(duì)線(xiàn)粒體和氧化相關(guān)基因的效應(yīng)與棕櫚酸單獨(dú)培養(yǎng)相對(duì)照;接著單獨(dú)以丁酸鈉處理細(xì)胞后觀察其對(duì)線(xiàn)粒體功能和線(xiàn)粒體相關(guān)復(fù)合體蛋白的變化趨勢(shì);最后檢測(cè)丁酸鈉處理細(xì)胞后線(xiàn)粒體功能相關(guān)的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）通路變化趨勢(shì)。結(jié)果 棕櫚酸可導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能相關(guān)PGC-1α轉(zhuǎn)錄受抑;相反，加入丁酸鈉與其共培養(yǎng)處理后細(xì)胞線(xiàn)粒體及氧化相關(guān)功能基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng);使用丁酸鈉培養(yǎng)細(xì)胞后線(xiàn)粒體蛋白復(fù)合體2轉(zhuǎn)錄增加，線(xiàn)粒體ATP生成明顯增加;1c1c7細(xì)胞使用丁酸鈉培養(yǎng)后，線(xiàn)粒體功能相關(guān)的cAMP通路有相應(yīng)變化，我們發(fā)現(xiàn)p-CREB表達(dá)增加同時(shí)PDE3B受抑制，表明cAMP通路的激活。結(jié)論 丁酸鈉可能通過(guò)cAMP通路介導(dǎo)其對(duì)肝臟脂肪變性中線(xiàn)粒體功能的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】丁酸鈉;脂肪肝;線(xiàn)粒體功能;環(huán)磷酸腺苷

Sodium butyrate promotes mitochondria biogenesis and lipid oxidation through activating cAMP pathway in fatty liver cell model Ke Bilun， Tan Siwei， Yi Jiazhi， Liu Huiling， Jiang Jie， Wu Bin. Depart-ment of Gastroenterology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Wu Bin， E-mail： wubin6@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To investigate the mechanism underlying the effect of sodium butyrate on protecting liver metabolism and its relationship with mitochondrial function. ?Methods The 1c1c7 cells were chosen for subsequent experiment. The expression levels of mitochondria and lipid oxidation-related genes and proteins and the production of adenosine triphosphate （ATP） were quantitatively detected. The 1c1c7 cells were cultured by palmitic acid to detect mitochondria-related genes. Subsequently， the cells were co-cultured with palmitic acid combined with sodium butyrate. The effect of palmitic acid combined with sodium butyrate and palmitic acid alone upon the mitochondria and lipid oxidation-related genes was statistically compared. The variation trend of mitochondrial function and mitochondria-related complex protein was observed after the cells were treated with sodium butyrate alone. The changes of the mitochondrial function-related cyclic adenosine monophosphate （cAMP） signaling pathway were detected following sodium butyrate treatment. Results Palmitic acid suppressed the translation of mitochondrial function-related PGC-1α. Conversely， palmitic acid combined with sodium butyrate treatment enhanced the translation of mitochondria and lipid oxidation-related genes. The translation of mitochondrial protein complex 2 and the production of mitochondrial ATP were strengthened after sodium butyrate treatment. The changes of mitochondrial function-related cAMP signaling pathway were observed after the 1c1c7 cells were cultured with sodium butyrate. The expression of p-CREB was up-regulated， whereas that of PDE3B was down-regulated， suggesting that the cAMP signaling pathway was activated. ?Conclusion Sodium butyrate probably mediates the protective effect upon the mitochondrial function via the cAMP signaling pathway in the in fatty liver cell model.

【Key words】Sodium butyrate;Fatty liver;Mitochondrial function;cAMP

近期有研究表明，丁酸鈉對(duì)動(dòng)物模型肥胖具有保護(hù)作用，并且其重要作用靶點(diǎn)是線(xiàn)粒體，相關(guān)研究表明其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可通過(guò)增加脂肪氧化、線(xiàn)粒體呼吸等對(duì)線(xiàn)粒體功能起到促進(jìn)作用。其作用的器官主要為肝臟，能改善高脂飲食模型下的脂肪肝狀態(tài)，在骨骼肌及棕色脂肪中也有類(lèi)似效應(yīng)[1]。由于長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì)線(xiàn)粒體功能主要表現(xiàn)為抑制及促凋亡，我們擬比較短鏈脂肪酸與其對(duì)線(xiàn)粒體功能的差異，并且用長(zhǎng)鏈、短鏈脂肪酸共同培養(yǎng)細(xì)胞，以模擬使用短鏈脂肪酸治療食源性脂肪肝的模型。我們的研究表明，丁酸鈉可以減輕由棕櫚酸造成的細(xì)胞線(xiàn)粒體相關(guān)蛋白和功能的損害，增加能量消耗，并且該作用可能通過(guò)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）通路介導(dǎo)。這為我們?nèi)蘸筮M(jìn)一步研究其對(duì)脂肪肝的保護(hù)機(jī)制、保護(hù)并促進(jìn)線(xiàn)粒體功能，并將丁酸鈉使用于臨床對(duì)脂肪肝的防治提供了初步依據(jù)。

材料與方法

一、材 料

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Fetal bovine serum， FBS）、PBS和0.05% EDTA胰酶均購(gòu)自GiBCO公司。無(wú)脂肪酸的胎牛血清（BSA，03117405001）購(gòu)自羅氏公司，棕櫚酸 （P5585）購(gòu)自Sigma公司，丁酸鈉（B5887）購(gòu)自Sigma公司。細(xì)胞蛋白提取液CytoBusterTM Protein Extraction Reagent購(gòu)自美國(guó)Novagen公司。溴酚藍(lán)、SDS、麗春紅S、吐溫-20℃、1.5 mol/L Tris-cl pH 8.8 和1 mol/L Tris-cl pH 6.8、丙烯酰胺均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker購(gòu)自Fermentas公司。脫脂牛奶購(gòu)自Cell signaling公司。PVDF膜和化學(xué)發(fā)光液Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。Restore Western BlotStripping Buffer購(gòu)自Thermo Scientific公司。DTT、 Apotinin、 NP40、PMSF購(gòu)自德國(guó)Boehringer公司。BCA Protein Assay Kit 購(gòu)自PierceTM。PCR： 定量PCR反應(yīng)試劑盒SuperScriptTMⅢ Platinum? SYBR? Green One-Step qRT-PCR Kit等購(gòu)自Invitrogen公司。Tris飽和酚、甘氨酸、氯仿、異丙醇、異戊醇、無(wú)水乙醇及NaCl、EDTA、NaOH、NaAc、K2HPO4、KH2PO4和甲醛、甲酰胺、蔗糖、甘油等均購(gòu)自Sigma公司。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

1c1c7細(xì)胞（上海中科院ATCC細(xì)胞庫(kù)）用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，飽和濕度和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 ～ 3 d傳代一次。接種密度約8×105/孔至6孔板中。分別將不同處理加入細(xì)胞培養(yǎng)液中按時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)及收取。首先使用0.3 mmol/L

胎牛血清作為對(duì)照，以及BSA 0.3 mmol/L棕櫚酸作為處理組培養(yǎng)細(xì)胞8 h，收取細(xì)胞提取RNA并檢測(cè)線(xiàn)粒體相關(guān)基因PGC-1α。隨后在6孔板培養(yǎng)的1c1c7細(xì)胞中加入0.3 mmol/L棕櫚酸作為對(duì)照組，以及0.3 mmol/L棕櫚酸+10 mmol/L丁酸鈉作為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)置1、4、8 h作為培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)后進(jìn)行RNA提取，檢測(cè)線(xiàn)粒體相關(guān)PGC-1α，脂肪氧化相關(guān)的CPT1α以及脂肪生成相關(guān)基因SREBP。接下來(lái)，按不同時(shí)間點(diǎn)（0、1、4、8、16 h）使用10 mmol/L丁酸鈉培養(yǎng)細(xì)胞及收取細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡試驗(yàn)，并按不同時(shí)間點(diǎn)（0、1、2、4、8、16、24 h）收取細(xì)胞使用ATP試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。最后，檢測(cè)cAMP通路表達(dá)情況，設(shè)置空白對(duì)照、10 mmol/L丁酸鈉組以及10 μmol/L forskolin處理細(xì)胞，8 h后收取細(xì)胞提取RNA檢測(cè)PDE3B轉(zhuǎn)錄情況;在1c1c7細(xì)胞中加入0.3 mmol/L棕櫚酸作為對(duì)照，以及0.3 mmol/L棕櫚酸+10 mmol/L丁酸鈉作為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)8 h后進(jìn)行RNA提取并檢測(cè);設(shè)置不同時(shí)間點(diǎn)（0、1、4、8、16 h）收取細(xì)胞提取蛋白檢測(cè)p-CREB及PDE3B以及內(nèi)參蛋白水平。

2. 細(xì)胞蛋白的收取及蛋白免疫印跡法試驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程完畢后，將培養(yǎng)皿放置于冰上，冰PBS液漂洗后用300 ml的裂解液，超聲裂解細(xì)胞6下3次。以12 000轉(zhuǎn)/分的速度，4℃離心15 min，吸取上清即為細(xì)胞裂解液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量并平衡濃度。加適量的4×loading buffer，混勻后，用水浴100℃煮沸5 min，以800轉(zhuǎn)/分的速度離心后，收集上清，于-70℃保存，蛋白待測(cè)分析。將樣品上樣至不同濃度的 SDS-PAGE分離膠，用適當(dāng)?shù)碾妷弘娪?、轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉后用相應(yīng)一抗溶液在4℃下?lián)u動(dòng)孵育過(guò)夜。次日洗膜后用HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，洗膜后暗房曝光。

3. RNA提取及PCR

培養(yǎng)細(xì)胞及收取細(xì)胞后，按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取RNA，測(cè)定濃度及純度，根據(jù)qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。應(yīng)用SYBR Green法對(duì)目的基因及內(nèi)參基因進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。

4. ATP活性檢測(cè)

收取細(xì)胞，配制ATP檢測(cè)試劑體系：D-Luciferin 10 mmol/L 0.2 ml， Luciferase， firefly recombinant 1 ml， Dithiothreitol （DTT）1 mmol/L 40 ml， 20× Reaction Buffer 0.2 ml， ddH2O 3.56 ml?？傮w積4 ml。配好后避光保存并于數(shù)小時(shí)內(nèi)使用。按濃度梯度配好ATP標(biāo)準(zhǔn)品作為參照。將樣品加入96孔板中，10 ml/孔，加入5個(gè)濃度梯度對(duì)照的ATP標(biāo)準(zhǔn)品。加入100 ml/孔的檢測(cè)液，立即于熒光下讀取數(shù)值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布定量資料用表示，2組間比較使用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、棕櫚酸培養(yǎng)導(dǎo)致1c1c7細(xì)胞線(xiàn)粒體相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的變化

使用0.3 mmol/L棕櫚酸造模8 h后收取細(xì)胞提取RNA并檢測(cè)線(xiàn)粒體相關(guān)基因PGC-1α，比較8 h后對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組區(qū)別。結(jié)果顯示1c1c7細(xì)胞PGC-1α在棕櫚酸培養(yǎng)后顯著降低（t =3.84，P=0.031），見(jiàn)圖1。

二、棕櫚酸對(duì)比棕櫚酸+丁酸鈉共培養(yǎng)對(duì)1c1c7細(xì)胞線(xiàn)粒體功能的變化

使用1c1c7細(xì)胞，加入0.3 mmol/L棕櫚酸作為對(duì)照組，以及0.3 mmol/L棕櫚酸+10 mmol/L丁酸鈉作為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)后進(jìn)行蛋白質(zhì)及RNA提取，檢測(cè)線(xiàn)粒體相關(guān)PGC-1α，脂肪氧化相關(guān)的CPT1α以及脂肪生成相關(guān)基因SREBP。結(jié)果顯示經(jīng)丁酸鈉共培養(yǎng)后，細(xì)胞線(xiàn)粒體相關(guān)PGC-1α（與1 h 棕櫚酸組進(jìn)行比較，4 h 棕櫚酸組 = 0.97±0.03，LSD-t = 0.18， P = 0.86; 8 h 棕櫚酸組 = 0.49±0.02，LSD-t = 4.03，P = 0.03; 1 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 2.36±0.12，LSD-t = 15.08，P < 0.01; 4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 4.77±0.24， LSD-t = 53.14， P < 0.01; 8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組=3.66±0.33，LSD-t = 188.05， P < 0.01; 4 h 棕櫚酸組與4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 79.55，P < 0.01; 8 h 棕櫚酸組與8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 274.21，P < 0.01）及脂肪氧化相關(guān)的CPT1α（與1 h 棕櫚酸組進(jìn)行比較，4 h 棕櫚酸組 = 1.80±0.13，LSD-t = 6.30， P < 0.01; 8 h 棕櫚酸組 = 1.19±0.03， LSD-t = 1.21， P=0.31; 1 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 1.50±0.09，LSD-t = 3.44， P =0.04; 4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 2.23±0.12， LSD-t = 3.38， P= 0.04; 8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 1.37±0.02， LSD-t = 2.65， P = 0.07; 4 h 棕櫚酸組與4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 3.39， P = 0.04; 8 h 棕櫚酸組與8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 6.88， P < 0.01）均比單純棕櫚酸培養(yǎng)升高，同時(shí)脂肪生成的SREBP（與1 h 棕櫚酸組進(jìn)行比較，4 h 棕櫚酸組 = 1.21±0.06，LSD-t = 1.65，P = 0.20;8 h 棕櫚酸組 = 1.13±0.02，LSD-t = 1.05，P = 0.37;1 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 0.98±0.05，LSD-t = 0.13， P = 0.90; 4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 0.54±0.03，LSD-t = 5.14， P = 0.01; 8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 0.27±0.03，LSD-t = 91.12， P < 0.01; 4 h 棕櫚酸組與4 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 47.69，P < 0.01; 8 h 棕櫚酸組與8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 689.60，P < 0.01）均較單獨(dú)棕櫚酸培養(yǎng)組下降，見(jiàn)圖2。

三、丁酸鈉對(duì)細(xì)胞線(xiàn)粒體復(fù)合體及ATP生成的影響

按不同時(shí)間點(diǎn)使用10 mmol/L丁酸鈉培養(yǎng)細(xì)胞及收取細(xì)胞，提取線(xiàn)粒體蛋白用于檢測(cè)各個(gè)復(fù)合體相關(guān)蛋白，并收取細(xì)胞使用ATP試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，線(xiàn)粒體復(fù)合體蛋白complex 2 SDHA及complex 3隨時(shí)間推移呈現(xiàn)明顯升高的趨勢(shì)，見(jiàn)圖3A。相應(yīng)的，隨著使用丁酸鈉培養(yǎng)時(shí)間的推移，細(xì)胞ATP產(chǎn)生隨時(shí)間增加而增加，其峰值約為8 ～ 16 h，提示其線(xiàn)粒體活性增加。不同時(shí)間點(diǎn)的樣本與初始對(duì)照組樣本的差異均有

統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1 h = 1.16±0.01，LSD-t = 41.45; 2 h

= 1.36±0.03，LSD-t = 106.54; 4 h = 1.67±0.03，LSD-t = 314.24; 8 h = 1.90±0.04， LSD-t = 441.66; 16 h = 1.69±0.09， LSD-t = 70.48; 24 h = 1.47±0.04， LSD-t = 110.04，P均< 0.01），見(jiàn)圖3B。此部分結(jié)果提示丁酸鈉處理可通過(guò)對(duì)線(xiàn)粒體復(fù)合體的作用，進(jìn)而刺激細(xì)胞線(xiàn)粒體相關(guān)功能。

四、丁酸鈉通過(guò)抑制PDE3B導(dǎo)致p-CREB表達(dá)，激活cAMP通路

cAMP通路在線(xiàn)粒體發(fā)揮各項(xiàng)生理功能時(shí)具有重要影響。由于丁酸鈉已被證實(shí)可促進(jìn)線(xiàn)粒體生成及功能，我們選取控制線(xiàn)粒體生成和調(diào)控的相關(guān)通路cAMP通路進(jìn)行研究。使用丁酸鈉及對(duì)cAMP通路抑制的forskolin處理細(xì)胞，8 h后收取細(xì)胞提取RNA檢測(cè)PDE3B轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可顯著降低PDE3B轉(zhuǎn)錄，而forskolin對(duì)PDE3B轉(zhuǎn)錄具促進(jìn)作用（與對(duì)照組比較，丁酸鈉組 = 0.50±0.06，LSD-t = 8.99， P < 0.01;forskolin = 2.35，LSD-t = 3.49，P = 0.04），見(jiàn)圖4A。使用1c1c7細(xì)胞，加入0.3 mmol/L棕櫚酸作為對(duì)照，以及0.3 mmol/L棕櫚酸+10 mmol/L丁酸鈉作為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)8 h后進(jìn)行RNA提取，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸導(dǎo)致PDE3B表達(dá)升高，而使用丁酸鈉共培養(yǎng)后，PDE3B水平較單獨(dú)棕櫚酸組下降（與1 h 棕櫚酸組比較，1 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 1.15±0.24，LSD-t = 0.54，P = 0.62; 8 h 棕櫚酸組 = 2.86±0.27，LSD-t = 12.59，P < 0.01; 8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組 = 1.89±0.08，LSD-t = 8.82，P < 0.01; 8 h 棕櫚酸組與8 h 棕櫚酸+丁酸鈉組比較，LSD-t = 5.19， P = 0.01），見(jiàn)圖4B。進(jìn)一步提取蛋白檢測(cè)通路相關(guān)的p-CREB及PDE3B，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可于蛋白水平上抑制PDE3B并促進(jìn)p-CREB表達(dá)，見(jiàn)圖4C。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明丁酸鈉可激活線(xiàn)粒體功能，并且可能是通過(guò)抑制PDE3B從而激活cAMP通路介導(dǎo)的，使用丁酸鈉處理細(xì)胞可減輕由棕櫚酸導(dǎo)致的線(xiàn)粒體功能下降。

討論

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是指除外酒精和其他明確的肝損害因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[2]。NAFLD在我國(guó)成人的患病率為10% ～ 30%，近年發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，現(xiàn)已成為我國(guó)最常見(jiàn)的慢性肝病之一[3]。

肝臟在能量代謝中有舉足輕重的作用，主導(dǎo)糖類(lèi)、蛋白和脂肪的代謝，而線(xiàn)粒體是代謝中主要起作用的細(xì)胞器，因此有一部分理論認(rèn)為，脂肪肝實(shí)質(zhì)上可被歸為線(xiàn)粒體病[4-5]。線(xiàn)粒體主導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)的β-氧化、細(xì)胞的氧化磷酸化以及介導(dǎo)凋亡等[6]。NAFLD的發(fā)病中，肝臟經(jīng)高脂處理后線(xiàn)粒體功能受損，并導(dǎo)致脂肪氧化、活性氧簇以及氧化壓力的變化，進(jìn)一步表現(xiàn)為線(xiàn)粒體相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄減少、線(xiàn)粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p等，相關(guān)反應(yīng)促進(jìn)凋亡，導(dǎo)致脂肪氧化及能量產(chǎn)生減少[7]。cAMP是主導(dǎo)代謝及線(xiàn)粒體功能的主要通路之一，眾所周知，其可主導(dǎo)線(xiàn)粒體對(duì)脂肪的氧化，以及在代謝中的其他重要作用，如脂肪分解、糖異生等，且通過(guò)PGC-1α控制線(xiàn)粒體生成[8-9]。

近年來(lái)，肝-腸軸在內(nèi)毒素對(duì)炎癥和代謝中的重要性越來(lái)越被重視。作為在腸道中占主要作用的短鏈脂肪酸，丁酸是研究相對(duì)充分的短鏈脂肪酸。初步研究表明其與改善腸道菌群及肥胖、胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)相關(guān)。我們的研究已經(jīng)證實(shí)了在小鼠模型上使用丁酸鈉腹腔注射能減輕內(nèi)毒素引起的肝臟損傷[10]。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉能促進(jìn)線(xiàn)粒體功能激活，主要表現(xiàn)為使ATP生成增加，并促進(jìn)部分線(xiàn)粒體復(fù)合體蛋白表達(dá)。我們使用棕櫚酸+丁酸鈉共培養(yǎng)以模擬高脂所致非酒精性脂肪肝狀態(tài)下，使用丁酸鈉治療的效果。區(qū)別于棕櫚酸導(dǎo)致線(xiàn)粒體損傷以及線(xiàn)粒體相關(guān)PGC-1α的表達(dá)減低，使用丁酸鈉共培養(yǎng)能明顯促進(jìn)PGC-1α較對(duì)照組的表達(dá)，并且激活脂肪氧化相關(guān)基因CPT1α。進(jìn)一步我們通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)粒體相關(guān)cAMP通路，發(fā)現(xiàn)使用丁酸鈉培養(yǎng)細(xì)胞后PDE3B抑制的同時(shí)p-CREB激活，這可能是丁酸鈉介導(dǎo)線(xiàn)粒體功能相關(guān)的分子機(jī)制。

丁酸鈉對(duì)細(xì)胞的作用是多方面的，我們的研究初步表明，在其作用下脂肪生成相關(guān)基因SREBP轉(zhuǎn)錄有明顯下降，這說(shuō)明丁酸鈉可能通過(guò)不止一種機(jī)制改善細(xì)胞的脂肪代謝狀態(tài)。目前為止，丁酸鈉對(duì)代謝的研究多在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，由于作為短鏈脂肪酸，丁酸鈉也具有脂肪酸的特性，培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)可能導(dǎo)致細(xì)胞單純脂肪積累的增加，這點(diǎn)在以丁酸鈉誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞成脂時(shí)已經(jīng)有體現(xiàn)，然而脂肪肝的形成不僅是脂肪積累的變化，依據(jù)二次打擊學(xué)說(shuō)甚至多次打擊學(xué)說(shuō)，細(xì)胞脂肪積累后導(dǎo)致的炎癥狀態(tài)、線(xiàn)粒體損傷等是進(jìn)一步導(dǎo)致脂肪肝進(jìn)展的關(guān)鍵因素。我們采用細(xì)胞模型，意圖減少在動(dòng)物模型上各器官和體內(nèi)激素水平等反饋造成的整體效應(yīng)。我們的研究結(jié)果表明丁酸鈉在肝細(xì)胞上可以增加ATP生成，促進(jìn)線(xiàn)粒體生成相關(guān)基因PGC-1α的表達(dá);使用棕櫚酸培養(yǎng)模擬高脂相關(guān)的脂肪肝模型，并加入丁酸鈉處理作為對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)使用丁酸鈉后，線(xiàn)粒體和脂肪氧化相關(guān)的PGC-1α、CPT1α以至于脂肪生成的SREBP都較棕櫚酸組明顯變化，提示了丁酸鈉處理的細(xì)胞相對(duì)有更高的線(xiàn)粒體活性、脂肪氧化，以及更低的脂質(zhì)生成。

本研究仍有待改進(jìn)之處，我們的研究主要在細(xì)胞模型上進(jìn)行，這可以更好地對(duì)細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)、通路進(jìn)行控制，然而它在機(jī)體整體水平內(nèi)丁酸鈉對(duì)代謝產(chǎn)生的效應(yīng)仍需探究。另外，有其他研究表明丁酸鈉可能通過(guò)不止一方面的機(jī)制對(duì)代謝產(chǎn)生影響，有報(bào)道表明其通過(guò)抑制組蛋白乙?；瘡亩{(diào)控腫瘤生成相關(guān)基因[11]。有研究發(fā)現(xiàn)向懷孕及哺乳期母鼠食物添加丁酸鈉，其子代骨骼肌線(xiàn)粒體表達(dá)PGC-1α、GPR43和GPR41都明顯上升[12]。另有研究證實(shí)短鏈及中鏈脂肪酸在內(nèi)皮及單核細(xì)胞內(nèi)可增強(qiáng)線(xiàn)粒體功能以及線(xiàn)粒體呼吸能力，并可一定程度上抵抗炎癥反應(yīng)帶來(lái)的線(xiàn)粒體損傷，具體通路未明，在肝臟中是否存在類(lèi)似反應(yīng)尚不明確，值得進(jìn)一步研究[13]。同時(shí)我們也未能對(duì)線(xiàn)粒體各復(fù)合體以及氧化磷酸化進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)，以確定丁酸鈉作用的具體靶復(fù)合體以及作用過(guò)程，這些都仍需深入研究。

綜上所述，本研究通過(guò)使用丁酸鈉培養(yǎng)肝細(xì)胞株1c1c7后檢測(cè)線(xiàn)粒體功能，以及對(duì)照丁酸鈉與棕櫚酸對(duì)1c1c7線(xiàn)粒體的作用，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可減輕棕櫚酸導(dǎo)致的線(xiàn)粒體功能下降，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可通過(guò)抑制PDE3B激活cAMP通路，這可能是丁酸鈉介導(dǎo)線(xiàn)粒體功能變化的機(jī)制。這對(duì)脂肪肝治療的臨床應(yīng)用可能起到一定的提示意義。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Mollica MP， Mattace Raso G， Cavaliere G， Trinchese G， De Filippo C， Aceto S，Prisco M， Pirozzi C， Di Guida F， Lama A， Crispino M， Tronino D， Di Vaio P， Berni Canani R， Calignano A， Meli R. Butyrate regulates liver mitochondrial function， efficiency， and dynamics in insulin-resistant obese mice. Diabetes，2017，66（5）：1405-1418.

[2] Jennison E， Patel J， Scorletti E， Byrne CD. Diagnosis and management of non-alcoholic fatty liver disease. Postgrad Med J，2019，95（1124）：314-322.

[3] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)脂肪性肝病專(zhuān)家委員會(huì).非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018更新版）. 傳染病信息，2018，31（5）：393-402，20.

[4] Pessayre D， Fromenty B. NASH： a mitochondrial disease. J Hepatol， 2005，42（6）：928-940.

[5] Li Z， Li Y， Zhang HX， Guo JR， Lam CWK， Wang CY， Zhang W. Mitochondria-mediated pathogenesis and therapeutics for non-alcoholic fatty liver disease. Mol Nutr Food Res，2019：e1900043. [Epub ahead of print]

[6] Caldwell SH， Chang CY， Nakamoto RK， Krugner-Higby L. Mitochondria in nonalcoholic fatty liver disease. Clin Liver Dis，2004，8（3）：595-617， x.

[7] Piantadosi CA， Suliman HB. Redox regulation of mitochondrial biogenesis. Free Radic Biol Med，2012，53（11）：2043-2053.

[8] Valsecchi F， Ramos-Espiritu LS， Buck J， Levin LR， Manfredi G. cAMP and mitochondria. Physiology （Bethesda），2013，28（3）：199-209.

[9] Than TA， Lou H， Ji C， Win S， Kaplowitz N. Role of cAMP-responsive element-binding protein （CREB）-regulated tran-scription coactivator 3 （CRTC3） in the initiation of mitochondrial biogenesis and stress response in liver cells. J Biol Chem，2011，286（25）：22047-22054.

[10] 羅千江， 李林， 魏振宇， 劉慧玲， 江潔， 尉秀清. 丁酸鈉減輕小鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)肝臟損傷的研究. 新醫(yī)學(xué)，2018，49（1）：19-24.

[11] Sch?nfeld P， Wojtczak L. Short- and medium-chain fatty acids in energy metabolism： the cellular perspective. J Lipid Res，2016，57（6）：943-954.

[12] Huang Y， Gao S， Jun G， Zhao R， Yang X. Supplementing the maternal diet of rats with butyrate enhances mitochondrial biogenesis in the skeletal muscles of weaned offspring. Br J Nutr，2017，117（1）：12-20.

[13] Hecker M， Sommer N， Voigtmann H， Pak O， Mohr A， Wolf M， Vadász I， Herold S， Weissmann N， Morty RE， Seeger W， Mayer K. Impact of short- and medium-chain fatty acids on mitochondrial function in severe inflammation. JPEN J Parenter Enteral Nutr，2014，38（5）：587-594.

（收稿日期：2019-06-28）

（本文編輯：楊江瑜）