陳偉棟 徐嘉 黃振華 古釬林 廖瑾莉 韋秋霞 詹紅

【摘要】目的探討膿毒癥患者外周血循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）數(shù)量及肱動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能（FMD）與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。方法納入膿毒癥患者15例為膿毒癥組，同期住院非膿毒癥患者巧例為非膿毒癥組，以Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)分化EPC，利用ac-LDL及Lectin抗體熒光標(biāo)記法進(jìn)行雙陽(yáng)性計(jì)數(shù);用彩色多普勒超聲檢查測(cè)定2組患者的FMD;以序貫器官功能衰竭估計(jì)（SOFA）評(píng)分評(píng)價(jià)患者病情嚴(yán)重程度。結(jié)果膿毒癥組患者EPC數(shù)量較非膿毒癥組少（33.9±7.7 vs.45.0±7.4，P<0.05），F(xiàn)MD測(cè)定值較低[（6.3±1.2）%VS.（7.7±0.9）%，P<0.05]。EPC數(shù)量與FMD測(cè)定值呈正相關(guān)（r_r=0.770，P<0.001）;膿毒癥組患者EPC數(shù)量與SOFA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r_s=-0.615、P<0.001），F(xiàn)MD測(cè)定值與SOFA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r_s=-0.636、P=0.011）。結(jié)論膿毒癥患者外周血循環(huán)EPC數(shù)量及FMD測(cè)定值或可作為評(píng)估膿毒癥病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】膿毒癥;內(nèi)皮祖細(xì)胞;肱動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能;序貫器官功能衰竭估計(jì)評(píng)分

膿毒癥是因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，是急診科常見(jiàn)的危重癥之一，發(fā)病率逐年升高，病死率高，救治困難[1-2]。機(jī)體發(fā)生膿毒癥時(shí)，病原體通過(guò)炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子等介導(dǎo)而引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷。血管內(nèi)皮功能損傷，一方面，血管舒張、毛細(xì)血管滲漏、內(nèi)皮腫脹等導(dǎo)致的炎性介質(zhì)浸潤(rùn)造成組織、器官微循環(huán)障礙，引發(fā)缺血、缺氧;另一方面，內(nèi)皮細(xì)胞直接參與免疫應(yīng)答，引起機(jī)體免疫功能下降，組織、器官對(duì)抗病原體能力下降，造成器官損傷進(jìn)一步加重[3-4]。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的一類具有干細(xì)胞潛能的前體細(xì)胞，能夠定向分化增殖形成成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而起到修復(fù)、再生血管作用。在心血管疾病、腦血管疾病、周圍血管疾病及腫瘤血管新生研究中，均證實(shí)了EPC在維持和修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能、血管新生中扮演重要角色[5]。肱動(dòng)脈血流介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能（FMD）能反映內(nèi)皮功能紊亂程度，F(xiàn)MD檢測(cè)是一種無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)的檢測(cè)血管內(nèi)皮功能的新技術(shù)[6]。在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中EPC數(shù)量和FMD變化及其作用機(jī)制迄今尚未明確。筆者通過(guò)測(cè)定膿毒癥患者循環(huán)EPC數(shù)量和FMD，就其與膿毒癥病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性進(jìn)行初步探討。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

連續(xù)納入2017年10月至2018年3月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科收治的膿毒癥患者15例為膿毒癥組，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016年拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng)制定的膿毒癥和膿毒癥休克診斷指南（Sepsis 3.0）[1]。15例中男5例、女10例;同時(shí)抽取同期住院的非膿毒癥患者15例作為非膿毒癥組，其中男6例、女9例。所有患者均排除以下情況：①既往有高血壓病、糖尿病、高脂血癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中、腫瘤病史;②孕婦;③年齡小于18歲。2組患者基線資料見(jiàn)表1。本研究由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，人組前所有患者或其家屬均簽署了知情同意書。

二、主要儀器與試劑

紅細(xì)胞裂解液、淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于中國(guó)碧云天公司，EBM-2培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，人纖維黏連蛋白購(gòu)于康寧公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）、乙酞化低密度蛋白（ac-LDL）一抗和外源凝集素（Lectin）一抗購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，4%多聚甲醛購(gòu)于雷根公司，日立彩色多普勒超聲診斷儀（型號(hào)TJ454）。

三、分離外周血單個(gè)核細(xì)胞及培養(yǎng)EPC

抽取2組患者外周靜脈血15ml，常溫下保存于肝素抗凝管。3h內(nèi)加入等體積PBS稀釋，抽取混合稀釋后的血液緩慢垂直加入等體積淋巴細(xì)胞分離液液面，常溫離心，400g×30min、小心吸取中間的白膜層置于15ml離心管，經(jīng)PBS 5ml洗滌2次，加入紅細(xì)胞裂解液后充分裂解，常溫離心，400g×10min。棄上清后加入EBM-2培養(yǎng)基，混合后均勻鋪于人纖維蛋白包被的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)第4日換液，第7日置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)[7]。

四、細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)7d后取一部分貼壁細(xì)胞在10μg/L的ac-LDL溶液中孵育1h，之后用4%多聚甲醛固定，以10μg/L的Lectin抗體溶液孵育1h，并置于熒光顯微鏡下觀察拍片，貼壁細(xì)胞吞噬ac-LDL熒光染色陽(yáng)性為紅色，Lectin抗體熒光染色陽(yáng)性為綠色，雙染色陽(yáng)性即紅色和綠色雙染色細(xì)胞為EPC，計(jì)算EPC數(shù)量[7]。

五、計(jì)算膿毒癥組與非膿毒癥組患者序貫器官功能衰竭估計(jì)（SOFA）評(píng)分

記錄2組患者循環(huán)血壓、氧合指數(shù)、肌酐、膽紅素、血小板計(jì)數(shù)及GCS評(píng)分，根據(jù)膿毒癥和膿毒癥休克診斷指南（Sepsis 3.0）進(jìn)行SOFA評(píng)分川。

六、受試者朧動(dòng)脈FMD測(cè)定值

使用日立彩色多普勒超聲診斷儀分別測(cè)定2組安靜狀態(tài)下、反應(yīng)性充血時(shí)肱動(dòng)脈內(nèi)徑變化。于右臂肘上2～3cm處探測(cè)肱動(dòng)脈，取其縱切面，調(diào)節(jié)增益直至前后壁內(nèi)膜顯示最清晰，同步在心電波形R波頂點(diǎn)處測(cè)量心室舒張末期時(shí)前后內(nèi)膜間距作為血管基礎(chǔ)內(nèi)徑。后行反應(yīng)性充血試驗(yàn)，將血壓計(jì)袖帶縛于前臂肘關(guān)節(jié)下2～3cm處，充氣加壓至250mm Hg（1mm Hg=0.133kPa），持續(xù)5min后迅速放氣，于放氣后1min內(nèi)測(cè)量朧動(dòng)脈內(nèi)徑。在測(cè)量過(guò)程中，超聲探頭始終固定于同一位置，測(cè)量同一處血管[8]。取3個(gè)心動(dòng)周期的平均值，計(jì)算充血實(shí)驗(yàn)前后差值與基礎(chǔ)內(nèi)徑比值。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布計(jì)量資料以x1s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn);非正態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示，組間比較用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率（百分比）表示，組間比較用Fisher確切概率法。相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、膿毒癥組與非膿毒癥組EPC數(shù)量和FMD測(cè)定值的比較

免疫熒光染色圖例見(jiàn)圖1A～C。比較膿毒癥組與非膿毒癥組EPC數(shù)量和FMD測(cè)定值，結(jié)果顯示膿毒癥組EPC數(shù)量為33.9±7.7，較非膿毒癥組45.0±7.4少（t=-3.63，P<0.05），見(jiàn)圖1D;膿毒癥組FMD測(cè)定值為（6.3±1.2）%，較非膿毒癥組的（7.7±0.9）%低（t=-4.05，P<0.05），見(jiàn)圖1E。

二、膿毒癥組和非膿毒癥組EPC、FMD與SOFA評(píng)分的相關(guān)分析結(jié)果

Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示EPC數(shù)量與FMD測(cè)定值呈正相關(guān)（r_s=0.770，P<0.001）。在膿毒癥組中進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示EPC數(shù)量與反映患者病情嚴(yán)重程度的SOFA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r_s=-0.615，P=0.015）、且FMD測(cè)定值與SOFA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r_s=-0.636，P=0.011）。

討論

機(jī)體發(fā)生膿毒癥時(shí)，病原體引起的各種炎癥介質(zhì)及細(xì)菌毒素釋放均可造成血管內(nèi)皮損傷，發(fā)生組織滲漏、有效循環(huán)血量減少、組織缺血缺氧加重，嚴(yán)重者最后發(fā)展至MODS。既往的研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度與膿毒癥患者的預(yù)后直接相關(guān)，內(nèi)皮功能損傷越嚴(yán)重的膿毒癥患者預(yù)后越差，病死率越高。血管內(nèi)皮損傷時(shí)，作為內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞的EPC從骨髓到損傷部位進(jìn)行修復(fù)及新生血管再生，在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能上發(fā)揮著重要作用。我們通過(guò)測(cè)定EPC的數(shù)量及肱動(dòng)脈FMD來(lái)反映血管內(nèi)皮功能，從而進(jìn)一步評(píng)估膿毒癥患者的病情嚴(yán)重程度。

本研究結(jié)果顯示膿毒癥組患者的EPC數(shù)量較非膿毒癥組少，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論相一致。Mayr等[9]發(fā)現(xiàn)，將小劑量的內(nèi)毒素注人人體可減少EPC數(shù)量。Zahran等[10]發(fā)現(xiàn)，在兒科膿毒癥患兒中，嚴(yán)重膿毒癥患兒EPC數(shù)量更低，EPC數(shù)量高的膿毒癥患兒生存率越高。Fan等[11]發(fā)現(xiàn)， EPC及基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子可改善膿毒癥患者預(yù)后。徐喜媛等[12]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，移植到膿毒癥小鼠體內(nèi)的EPC可成功通過(guò)血管進(jìn)人肺、肝、腎等組織，下調(diào)促炎反應(yīng)程度，提高小鼠的生存率，預(yù)示EPC移植或可改善膿毒癥患者預(yù)后。我們使用經(jīng)典的SOFA評(píng)分對(duì)膿毒癥患者進(jìn)行器官損傷的評(píng)分，發(fā)現(xiàn)EPC數(shù)量與SOFA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，提示EPC數(shù)量可以反映膿毒癥患者的病情嚴(yán)重程度。嚴(yán)重膿毒癥時(shí)EPC數(shù)量明顯下降可能與骨髓抑制、EPC損傷破壞、炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)EPC凋亡有關(guān)，具體機(jī)制尚未明確[13]。

FMD檢測(cè)是一種無(wú)創(chuàng)的檢查方法，F(xiàn)MD測(cè)定值已被廣泛認(rèn)可作為血管內(nèi)皮功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究中2組患者外周血循環(huán)EPC數(shù)量與FMD測(cè)定值呈正相關(guān)，提示EPC數(shù)量可以正向反映患者的血管內(nèi)皮功能，膿毒癥時(shí)EPC數(shù)量下降伴隨FMD測(cè)定值減低，血管內(nèi)皮功能受損。

我們進(jìn)行FMD測(cè)定值與SOFA評(píng)分的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈負(fù)相關(guān)，即SOFA評(píng)分越高，F(xiàn)MD測(cè)定值越低，表明FMD測(cè)定值可以用于評(píng)價(jià)膿毒癥患者的病情嚴(yán)重程度。

總之，膿毒癥患者外周血循環(huán)EPC數(shù)量減少，F(xiàn)MD測(cè)定值降低，且與SOFA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，因此可通過(guò)無(wú)創(chuàng)的方法測(cè)定肱動(dòng)脈FMD及循環(huán)EPC數(shù)量來(lái)評(píng)估器官損傷程度，預(yù)測(cè)病情預(yù)后，為臨床評(píng)估膿毒癥病情提供新的檢測(cè)手段。EPC或可作為評(píng)估膿毒癥嚴(yán)重程度新的分子生物學(xué)標(biāo)志物和重要治療靶點(diǎn)，相關(guān)機(jī)制需作進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2018-12-20）

（本文編輯：洪悅民）

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2019.05.010

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81801948）;廣東省自然科學(xué)基金（2016A030313249）;廣州市科技項(xiàng)目（201804010007）

作者單位：510080 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科

通信作者，詹紅，E-mail：zhanhong81@126.com