田 麗，時(shí)邵輝，胡虹宇，陳勝男，李松美，王春生

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

Oct4是POU(Pit-Oct-Unc)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，由Pou5f1基因編碼[1,2]。它一般通過(guò)與保守序列的八個(gè)堿基“ATGCAAAT”結(jié)合，參與調(diào)控下游的基因。Oct4作為多能性基因是最早被發(fā)現(xiàn)的，主要在受精卵、桑椹胚(morula)、卵裂球、囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以及著床后胚胎的上胚層(epiblast)和原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs)等多能性細(xì)胞中表達(dá)[3]。例如在小鼠中，將Oct4基因敲除，該胚囊正常植入后不能形成多能性的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，因此不能正常著床而停滯發(fā)育，在著床前期囊胚階段（胚胎發(fā)育3.5～4.5 d）死亡。表明Oct4基因在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中形成多能性細(xì)胞是必要的[4]。同時(shí)研究表明，在體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞中Oct4基因受到精確調(diào)控，只有當(dāng)Oct4在一定范圍內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞可保持未分化狀態(tài)。當(dāng)Oct4表達(dá)量比兩倍正常水平還要高時(shí)，可導(dǎo)致ES細(xì)胞向原始內(nèi)胚層(primitive endoderm)和中胚層分化；當(dāng)表達(dá)量低于正常水平50%時(shí)，ES細(xì)胞將會(huì)向滋養(yǎng)層（trophectoderm）和原始內(nèi)胚層分化[5]。但在去除外源性抑制因子的情況下，即使有Oct4基因，ES細(xì)胞也會(huì)呈現(xiàn)出分化狀態(tài)，這說(shuō)明Oct4不是維持ES細(xì)胞亞全能分化特性的唯一條件，同時(shí)也證明了Oct4在ES細(xì)胞中的表達(dá)確實(shí)經(jīng)過(guò)精確調(diào)控，其表達(dá)水平?jīng)Q定了ES細(xì)胞的命運(yùn)[6]。Oct4基因不僅在ES細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮重要作用，還是用于產(chǎn)生iPS細(xì)胞的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子混合物中必需的中心重編程因子[7]。

目前，已經(jīng)克隆了人[8]、豬[9-11]、牛[12]和小鼠[13]等物種的Oct4基因，與其他動(dòng)物相比，關(guān)于綿羊Oct4基因的相關(guān)報(bào)道很少。在本研究中，從體外發(fā)育的囊胚中擴(kuò)增出綿羊Oct4基因編碼區(qū)序列，在此基礎(chǔ)上，預(yù)測(cè)了綿羊Oct4所表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并與其他物種進(jìn)行了比較，為進(jìn)一步研究綿羊Oct4基因的功能及利用綿羊源因子誘導(dǎo)綿羊體細(xì)胞重編程研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、載體和菌株

rTaq DNA聚合酶、T4連接酶、Oligo15引物、iPrep Trizol Plus RNA試劑盒（Invitrogen)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）、質(zhì)粒小提小量試劑盒（BioTeke）、膠回收試劑盒（Omega）；pMD18-T 載體；Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞（TransGen Biotech）。

1.2 綿羊囊胚總RNA的提取

按iPrep Trizol Plus RNA試劑盒的說(shuō)明書提綿羊囊胚總RNA，置于-80℃冰箱保存。

1.3 總cDNA的獲得

將上述總 RNA 1μg、Oligo15（50uM）1 μL加入 0.2 mL微量離心管中，用 RNase-free H2O 補(bǔ)齊至10 μL，70 ℃水浴 10 min，2 min 冰浴，然后依次添加 5×M-MLV Buffer 2 μL、dNTP（10mM）0.5 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、RTase M-MLV 5 μL 和 RNase-free H2O 0.75 μL，42 ℃水浴 1 h，70 ℃保溫 15 min，冰浴幾分鐘，獲得總cDNA，-20℃條件下保存，用于擴(kuò)增綿羊Oct4基因。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中牛Oct4基因的CDS部分，與綿羊基因組作對(duì)比，得到5個(gè)同源序列片段，連接片段，和牛Oct4基因的CDS同源性為97.78%，對(duì)應(yīng)氨基酸序列同源性為98.33%，推測(cè)該序列為綿羊Oct4基因的CDS區(qū)，設(shè)計(jì)該基因上下游引物，并分別引入適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)。引物由大連TaKaRa公司合成，引物 相 關(guān) 信 息 如 下 ：Oct4-1 5’： GGGAATTATGGCGGGACACCTCGCTTC3’； Oct4-2 5’：GGGCTCGTCAGTTTGAATGCATAGGA 3’。

1.5 Oct4基因的擴(kuò)增

基于上述實(shí)驗(yàn)所得到的cDNA模板，Oct4-1和Oct4-2作為引物，PCR擴(kuò)增Oct4基因。PCR反應(yīng)體系（總 25 μL）：cDNA 1μL，dNTP（2.5 mM）4μL，rTaq Buffer（10x）2.5 μL，上下游引物各 1 μL，rTaq 酶 0.3 μL。PCR 反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性 5min；94°C變性 30 S，58°C退火 45 S，72℃延伸90 s，共 30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min。

膠回收PCR產(chǎn)物。室溫條件下，與pMD18-T simple載體連接10 min，用5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL Trans5α型感受態(tài)細(xì)胞，涂平板，用Amp抗性及藍(lán)白斑一起進(jìn)行篩選，挑取白色克隆菌株于含有Amp的LB培養(yǎng)基中，置于搖床中震蕩培養(yǎng)，擴(kuò)大克隆菌株，質(zhì)粒小提小量試劑盒提取質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindII雙酶切，通過(guò)酶切鑒定連接正確的Oct4-pMD18重組質(zhì)粒，并送Invitrogen公司測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

分別使用NCBI blastn程序和DNAMAN軟件比對(duì)核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列，并利用NCBI網(wǎng)站上的ORF finder分析軟件對(duì)開放閱讀框(ORF)進(jìn)行識(shí)別。使用DNAMAN5.2軟件對(duì)高同源蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用PlantsP(http：//plantsp.genomics.purdue.edu/html/)和ScanProsite軟件(http：//us.expasy.org/prosite/)對(duì)蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。使用Psort軟件(http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/)定位Oct4蛋白的亞細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增綿羊Oct4基因

Oct4-1和Oct4-2作為擴(kuò)增引物，RT-PCR擴(kuò)增獲得的模板cDNA，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，紫外燈照射下可見凝膠上呈現(xiàn)出約1 100 bp的目的條帶（圖1-3）。

圖1 Oct4基因PCR擴(kuò)增

圖2 pMD18-T simple-Oct4質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

圖3 pMD18-T simple-Oct4質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.2 綿羊Oct4編碼區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列分析

生物軟件分析測(cè)序正確的Oct4-pMD18重組質(zhì)粒，分析表明綿羊Oct4基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1 083 bp包括終止密碼子在內(nèi)，可以編碼360個(gè)氨基酸。綿羊Oct4基因CDS區(qū)的核苷酸序列相比與牛、貓、人、恒河猴、小鼠、兔、大鼠和豬等物種，相應(yīng)序列的同源性分別為97.8%、91.1%、89.1%、89.0%、82.3%、85.7%、83.2和94.7（圖 4），其氨基酸序列同源性分別為 98.3%、93.1%、91.4%、91.1%、83.8%、85.7%和 97.2（圖 5）。

圖4 綿羊Oct4基因CDS序列與其他物種同源性分析

圖5 綿羊Oct4蛋白氨基酸序列與其他物種同源性分析

利用DNAMAN軟件獲得了九種動(dòng)物Oct4基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，與綿羊親緣關(guān)系最接近的是牛，具有很小的遺傳距離；與豬、貓、兔、人、恒河猴、小鼠及大鼠親緣關(guān)系依次變遠(yuǎn)，基本上與傳統(tǒng)分類學(xué)保持一致（圖6）。

圖6 九個(gè)物種Oct4基因編碼區(qū)核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 分析綿羊Oct4蛋白三維結(jié)構(gòu)

利用在線軟件（http：//prosite.expasy.org/）對(duì)綿羊Oct4基因進(jìn)行分析，分析表明在156-168位氨基酸（KRItLGYtQaDVG）和180-193位氨基酸（SQTTICRFEaLqLS）含有兩個(gè) POU結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)構(gòu)（如圖7），在263-286位氨基酸含有1個(gè)HOMEOBOX-1結(jié)構(gòu)域（IAqqLgLEkdVVRVWFcNrrqkgK）。

圖7 綿羊Oct4蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論與討論

Oct-4是動(dòng)物種系之間具有高度保守性的POU轉(zhuǎn)錄因子，也是迄今發(fā)現(xiàn)最早也是最重要的維持胚胎干細(xì)胞多潛能性和促進(jìn)自我更新的關(guān)鍵因子[14,15]。它的表達(dá)水平不僅決定了ES細(xì)胞的命運(yùn)，影響其分化狀態(tài)，還在誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞成為多功能干細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16-18]。豬和牛等家畜的Oct4基因已經(jīng)被克隆，分子特性也已被闡明[9-12,19]。但迄今為止，尚未見到有關(guān)綿羊Oct4基因的相關(guān)報(bào)道。由于Oct4基因具有強(qiáng)組織表達(dá)特異性，僅表達(dá)與胚胎干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞等具有多潛能性的細(xì)胞中，隨細(xì)胞的分化表達(dá)量下降，體細(xì)胞中未見表達(dá)，所以O(shè)ct4基因的克隆十分困難。Bao L等[20]也曾嘗試?yán)眯∈蟮倪@四個(gè)因子誘導(dǎo)綿羊體細(xì)胞重編程，結(jié)果表明誘導(dǎo)效率較低，被誘導(dǎo)的細(xì)胞不能啟動(dòng)內(nèi)源多能性基因的表達(dá)。研究組推測(cè)各因子氨基酸同源性的不同導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)更大的差異是造成異源因子誘導(dǎo)效率低的重要原因之一。因此，為克隆獲得綿羊的Oct4基因序列，本研究利用牛Oct4基因的CDS序列與GenBank的綿羊基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，推測(cè)為綿羊Oct4基因的5個(gè)外顯子，并將該5個(gè)外顯子拼接，序列包含1083個(gè)堿基，為3的整數(shù)倍，且包含終止密碼子“TGA”。針對(duì)該序列設(shè)計(jì)引物，從綿羊囊胚的cDNA中擴(kuò)增獲得一段基因序列（見圖1-3），該序列與牛CDS的同源性高達(dá)97.8%，與其他物種Oct4基因具有82.3%以上的同源性，具有較高的同源性（見圖4）。與此同時(shí)，推測(cè)的氨基酸序列與牛的同源性高達(dá)98.3%（見圖5）。對(duì)本研究中獲得的Oct4基因的編碼序列分析顯示，Oct4定位于細(xì)胞核中（圖7）并含有符合Pou box氨基酸的統(tǒng)一序列。這些結(jié)果說(shuō)明，Oct4調(diào)控綿羊細(xì)胞分化過(guò)程的機(jī)制可能與其他動(dòng)物相同。

綜上所述，本研究通過(guò)整理和合成成功獲得了綿羊的Oct4基因，但該基因是否可用于提高綿羊iPS的誘導(dǎo)效率需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。