李 滾，張 濤，楊鑫榮，盧香香

(西安工業(yè)大學(xué) 電子信息工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，西安 710021)

乙肝病毒屬于DNA病毒，具有嗜肝性，該病毒感染會演變成肝炎甚至發(fā)展成肝硬化，相關(guān)疾病給患者及其家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。乙肝病毒是一個相當(dāng)小的病毒，成環(huán)狀、部分為雙鏈DNA。乙肝病毒編碼的幾種蛋白中S蛋白是病毒的包膜蛋白，與病毒進入細(xì)胞有關(guān)，吸引了眾多學(xué)者關(guān)注[1-2]。乙肝病毒S蛋白由226個氨基酸組成，屬于疏水蛋白質(zhì)[3]。乙肝病毒S蛋白是乙肝病毒亞病毒顆粒的主要組成部分，它的數(shù)量遠(yuǎn)比乙肝病毒顆粒多。以往研究者曾用生物信息學(xué)方法逐一對乙肝病毒基因區(qū)段的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系進行分析，不僅證明了乙肝病毒中部分功能區(qū)域的性質(zhì)，而且發(fā)現(xiàn)了包膜蛋白上潛在的新功能域[4]。乙肝病毒大蛋白由S、PreS2和PreS1基因編碼的HBsAg、PreS2和PreS1共同構(gòu)成，已有部分研究證實乙肝病毒S大蛋白能夠激活基因轉(zhuǎn)錄過程，促進肝癌發(fā)生，然而乙肝病毒S大蛋白在肝癌形成過程中所發(fā)揮的作用依然有很多問題有待研究?，F(xiàn)有的乙肝免疫球蛋白都是針對乙肝病毒S蛋白的免疫球蛋白。和通過血液提純的免疫球蛋白途徑相比，單克隆抗體靶點清晰，靈敏度更高，特異性更強，同時，抗體的特異性結(jié)合能力和中和病毒的能力是評價中和抗體的關(guān)鍵指標(biāo)。對乙肝病毒S蛋白進行深入研究有利于乙肝病毒的預(yù)防、診斷以及表位疫苗的研制[5]。本論文利用生物信息學(xué)方法分析乙肝病毒S蛋白的序列特征和抗原表位，預(yù)測該蛋白的抗原性，為進一步研究S蛋白結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能提供參考依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

登陸NCBI網(wǎng)站，從GenBank(NIH遺傳序列數(shù)據(jù)庫)數(shù)據(jù)庫中獲取乙肝病毒S蛋白氨基酸序列(檢索號：ATY75544.1)。

1.2 方法

利用https://web.expasy.org/protparam/ 網(wǎng)站統(tǒng)計與計算乙肝病毒S蛋白序列組成；利用https://web.expasy.org/protparam/網(wǎng)站分析乙肝病毒S蛋白的親水性(疏水性)；利用https://npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page= npsa_ sopma. html網(wǎng)站分析乙肝病毒S蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網(wǎng)站分析乙肝病毒S蛋白的信號肽特征；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網(wǎng)站分析乙肝病毒S蛋白的跨膜區(qū)；利用http://tools.immuneepitope.org/bcell 網(wǎng)站預(yù)測乙肝病毒S蛋白最佳抗原表位形成位置；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/網(wǎng)站分析乙肝病毒S蛋白的磷酸化位點[6]。并將上述各預(yù)測的數(shù)值化結(jié)果進行重新繪圖并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙肝病毒S蛋白序列的基本組成成分

乙肝病毒S蛋白由226個氨基酸組成，分子質(zhì)量單位(Mr)為25 387.14。如圖1所示，圖中縱坐標(biāo)表示不同的氨基酸，226個氨基酸中亮氨酸(Leu)、絲氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、蘇氨酸(Thr)含量較高，分別占氨基酸總數(shù)的35%、25%、22%、19%。脂肪系數(shù)是99.60。理論等電點是8.21，原子總數(shù)是3 569。帶負(fù)電荷殘基的Asp(天冬氨酸)和Glu(谷氨酸)的數(shù)目是27，帶正電荷殘基的Arg(精氨酸)和Lys(賴氨酸)的總數(shù)目是18。N端的蛋白的為Met，S蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)是59.66，預(yù)測S蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。乙肝病毒S蛋白的半衰期在體外的哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞內(nèi)是30 h，在酵母體內(nèi)大于20 h，在大腸桿菌內(nèi)大于10 h。

2.2 乙肝病毒S蛋白的親水性(疏水性)

乙肝病毒S蛋白的總平均親水性為0.649，可能是疏水蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的組成成分氨基酸的側(cè)鏈大部分或者全部由碳原子和氫原子組成，不太可能與水分子形成氫鍵。圖2疏水性的測試結(jié)果集中反映了不同氨基酸位置的親疏水性分布情況，閾值線為0，閾值線以上部分的氨基酸殘基表現(xiàn)為疏水性，閾值線以下部分的氨基酸殘基表現(xiàn)為親水性?？梢钥闯鲈?130-170)和(190-210)位置為高疏水值區(qū)域，附近可能存在潛在跨膜區(qū)。

圖2 S蛋白疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.2 Hydrophobicity prediction results for S protein

2.3 乙肝病毒S蛋白的二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中的氨基酸的組成和排列順序決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。二級結(jié)構(gòu)對其功能的影響較大，蛋白質(zhì)進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測是確定抗原表位，即確定抗原抗體結(jié)合部位的一種輔助手段[35]。乙肝病毒的S蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)見圖3，其中藍(lán)色表示α螺旋，有72處氨基酸為α螺旋約占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的31.86%；綠色表示β轉(zhuǎn)角，有17處氨基酸為β轉(zhuǎn)角約占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的7.52%；紅色表示β折疊，有44處氨基酸為β折疊約占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的19.47%；紫色表示無規(guī)則卷曲，有93處氨基酸為無規(guī)則卷曲約占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的41.15%。由β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成的區(qū)域占48.67%，表明在乙肝病毒 S蛋白的這些區(qū)域中，抗原表位容易產(chǎn)生[7]。(彩圖見電子版：http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx.2019年第2期)。

圖3 S蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of S protein

2.4 乙肝病毒S蛋白的信號肽、跨膜區(qū)及磷酸化位點分析

信號肽的本質(zhì)是一段氨基酸序列，一般位于多肽鏈的末端，在蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運過程中起作用。如圖4所示，S經(jīng)常被用于預(yù)測信號肽的剪切位點[8]，該預(yù)測結(jié)果中S分值最大為0.606，大于信號肽閾值0.5，S分值與閾值線的交點處的氨基酸位點為5，說明乙肝病毒S蛋白存在信號肽。且信號肽長度為5個氨基酸殘基，該蛋白的剪切部位在5-6氨基酸處。5氨基酸之后S分值較小這部分蛋白為成熟蛋白。

圖4 S蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果Fig.4 Signal peptide prediction results for S protein

跨膜區(qū)是指蛋白質(zhì)氨基酸序列中跨越細(xì)胞膜的區(qū)域。如圖5所示，藍(lán)色表示細(xì)胞膜內(nèi)，綠色表示細(xì)胞膜外，紅色部分表示跨膜區(qū)。乙肝病毒S蛋白存在4個跨膜區(qū)位置分別是7-29，80-98，170-192，202-224。(彩圖見電子版：http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx.2019年第2期)。

圖5 乙肝病毒S蛋白跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果Fig.5 Transmembrane region prediction results of S protein

如圖6所示，紅色表示絲氨酸，綠色表示蘇氨酸，藍(lán)色表示酪氨酸。乙肝病毒S蛋白存在7個蘇氨酸磷酸化位點，22個絲氨酸磷酸化位點，1個酪氨酸磷酸化位點，表明乙肝病毒S蛋白有30個潛在的磷酸化位點。(彩圖見電子版：http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx.2019年第2期)。

圖6 乙肝病毒S蛋白磷酸化位點Fig.6 Phosphorylation site of S protein in hepatitis B virus

2.5 乙肝病毒S蛋白最佳抗原表位位置預(yù)測

對乙肝病毒S蛋白進行可及性分析，可及性分析集中體現(xiàn)了乙肝病毒S蛋白抗原中氨基酸殘基的分布情況。可及性越大說明相應(yīng)的氨基酸殘基更容易與抗體結(jié)合。如圖7所示，閾值線以上均為S蛋白抗原中氨基酸殘基可被溶劑分子接觸的部分，得分較高的氨基酸區(qū)域有10個分別為：0-3、24-34、48-62、66-69、96-99、109-118、122-132、139-143、165-168、198-204。

圖7 乙肝病毒S蛋白可及性Fig.7 Accessibility of S protein in hepatitis B virus

對乙肝病毒S蛋白進行線性表位分析，線性表位預(yù)測對于多種免疫研究是必不可少的，選擇有效的線性表位有利于順利進行抗體制備。如圖8所示，黃色部分即閾值線以上部分的線性表位對應(yīng)的氨基酸位點較為適合作為抗原抗體結(jié)合部位，得分高的閾值線以上區(qū)域有7個分別為：0-8、25-36、46-69、100-155、165-168、182-188、200-206。(彩圖見電子版：http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx.2019年第2期)。

圖8 乙肝病毒S蛋白線性表位Fig.8 Linear epitope of S protein in hepatitis B virus

對乙肝病毒S蛋白進行β轉(zhuǎn)角結(jié)果預(yù)測，β轉(zhuǎn)角一般處于蛋白質(zhì)表面位置，為凸出結(jié)構(gòu)，經(jīng)常發(fā)生扭曲結(jié)構(gòu)較為松散，更容易與抗體結(jié)合，由于β轉(zhuǎn)角中的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性的特殊性，使得β轉(zhuǎn)角存在區(qū)域易形成抗原表位。本論文的抗原表位預(yù)測結(jié)果中閾值為1。如圖9所示，得分高的區(qū)域即閾值線以上的綠色區(qū)域有6個分別為：0-6、27-34、37-39、47-70、102-153、195-204。

圖9 S蛋白β轉(zhuǎn)角預(yù)測結(jié)果Fig.9 β angle prediction results for S protein

對乙肝病毒S蛋白進行抗原性與分子量、化學(xué)組成、立體結(jié)構(gòu)有關(guān)?？乖栽酱螅瑢?yīng)的氨基酸越穩(wěn)定，越容易形成抗原位點。圖10為對乙肝病毒S蛋白進行抗原性結(jié)果預(yù)測的結(jié)果，得分較高的綠色閾值線以上區(qū)域有10個分別為：9-19、43-49、63-69、76-99、103-108、132-138、146-151、172-184、187-191、200-224。綜合分析乙肝病毒S蛋白的可及性、線性表位、β轉(zhuǎn)角、柔性、抗原性得到的潛在抗原表位有2個區(qū)域，分別為：48-49、66-69。

圖10 乙肝病毒S蛋白抗原性Fig.10 Antigenicity of S protein in hepatitis B virus

3 討 論

抗原表位是指位于抗原分子中的一種特殊的化學(xué)基團，對抗原特異性起決定性作用，抗原通過抗原表位完成免疫效應(yīng)。表位疫苗是一種新型疫苗，在艾滋病等病毒上已經(jīng)取得了初步研究進展。表位疫苗是指通過基因工程的手段，體外培養(yǎng)或人工合成微生物的表位，將得到的表位作為一種疫苗使用[9]。與傳統(tǒng)疫苗相比，表位疫苗更加穩(wěn)定安全[10]。為了提高抗原表位預(yù)測的準(zhǔn)確性，基于蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，在此基礎(chǔ)上進一步對乙肝病毒S蛋白的可及性、線性表位、β轉(zhuǎn)角、抗原性進行預(yù)測分析，選出利用不同性質(zhì)分析結(jié)果中相同區(qū)域，作為最佳抗原表位位置，綜合分析得到的潛在抗原表位有2個區(qū)域，分別為：48-49、66-69。

乙型肝炎由乙型肝炎病毒引發(fā)，是一種全球性疾病，全世界乙型肝炎的慢性感染者約有4億人。因為乙型肝炎危害極大，流傳廣，因此各國科學(xué)家對乙肝病毒的防治方法給予了高度的重視[11]。乙肝病毒頑強的抵抗力和潛伏性是乙肝病毒難以治愈的主要原因。蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測是生物學(xué)研究的熱點之一[12]。自1965年乙肝病毒被發(fā)現(xiàn)就一直是一項難以攻克的難題，在現(xiàn)今的醫(yī)療水平上乙肝病毒幾乎可以說是一種可以被控制，但不能被徹底殺死的病毒。乙肝病毒S蛋白在人體內(nèi)的不僅會對肝臟造成傷害，還會通過影響男性患者的精子存活率以及受精能力導(dǎo)致生育能力下降[13]。關(guān)于乙肝病毒S蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果，是基于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點、數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)以及計算機分析得到的。這些預(yù)測結(jié)果對深入研究乙肝病毒、表位疫苗的研制具有指導(dǎo)意義，但還不能完全照搬，必須設(shè)計相應(yīng)的實驗進行驗證，才能真正應(yīng)用于乙肝病毒的防治過程。

李晉濤等人預(yù)測了一種抑制蛋白的表面特性和二級結(jié)構(gòu)，采取多參數(shù)分析法進行預(yù)測，如對可塑性和親水性、免疫原性和理化性質(zhì)等方面進行分析，發(fā)現(xiàn)該抑制蛋白存在多個潛在的抗原表位[14]。黃繼華采用多種方法檢測乙肝病毒S蛋白對人精子凋亡和受精能力的影響，結(jié)果證明乙肝病毒S蛋白在精子的凋亡過程中發(fā)揮作用，因此精子的線粒體的部分功能甚至于受精能力都會受到不同程度的影響[15]。丁悅等人的系列 研究表明乙肝病毒的主要構(gòu)成成分乙肝病毒S蛋白能夠引起精子線粒體膜電位、精子活力、受精能力顯著下降，并導(dǎo)致精子大量死亡。同時，乙肝病毒S蛋白還可引起人精子產(chǎn)生氧化應(yīng)激影響細(xì)胞膜的完整性，并進一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而影響精子的功能[16]。本研究對乙肝病毒S蛋白運用生物信息學(xué)知識進行序列特征分析，成功預(yù)測到S蛋白的基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能特征以及潛在的抗原表位所在位置，這些數(shù)據(jù)在一定程度上將作為對乙肝病毒以及乙肝病毒S蛋白深入研究和表位疫苗研制、免疫診斷的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

乙肝病毒存在逆轉(zhuǎn)錄過程并且具有極強的潛伏性。應(yīng)用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站進行乙肝病毒S蛋白的序列特征分析，并在分析的基礎(chǔ)上研究乙肝病毒S蛋白的生物學(xué)特性。研究結(jié)果顯示：(1)乙肝病毒S蛋白是不穩(wěn)定蛋白，很難與水分子形成氫鍵屬于疏水蛋白質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)中α螺旋與無規(guī)則卷曲占大多數(shù)，同時乙肝病毒S蛋白存在信號肽、跨膜區(qū)以及潛在的磷酸化位點。(2)結(jié)合乙肝病毒S蛋白的序列可及性、線性表位、β轉(zhuǎn)角、柔性、抗原性的預(yù)測結(jié)果，可以找到最合適的氨基酸位點進行抗原抗體結(jié)合，形成抗原表位，綜合分析得到的潛在抗原表位有2個區(qū)域，分別為：48-49、66-69。研究結(jié)果可以作為表位疫苗的研制依據(jù)，有利于進一步研究乙肝病毒S蛋白的抗原性，對乙肝病毒S蛋白的研究進展有促進作用。