李 明，孫 偉

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院藥學(xué)部 北京 100070；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100070）

1 前言

植物的表皮毛（trichomes）是植物葉片和其他器官的表面突起。植物的表皮毛通常被稱(chēng)為腺毛是植物重要的保護(hù)組織及次生代謝產(chǎn)物分泌的場(chǎng)所。腺毛可以通過(guò)分泌特定的物質(zhì)從而對(duì)抗侵蝕者、微生物的侵?jǐn)_。從形態(tài)學(xué)上可以把表皮毛劃分為兩類(lèi)細(xì)胞分別是單細(xì)胞非腺性的，一類(lèi)是多細(xì)胞的腺性的[1]。有些植物可能只具有一類(lèi)腺毛類(lèi)型，但大多數(shù)植物往往兼有兩種腺毛類(lèi)型。植物各個(gè)器官表皮分布著由角質(zhì)層和疏水的蠟質(zhì)層組成的化學(xué)物質(zhì)，它們可以有效的增加植物的表皮機(jī)械力，同時(shí)由于不同組織間角質(zhì)層和蠟質(zhì)層的比例不一樣，其各個(gè)器官的屬性也就有著較大的區(qū)別。從通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)模式植物擬南芥研究后發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的glassy hair 6(glh6)和ATP-binding cassette G family member 11(abcg11)等基因也參與著表皮角質(zhì)層和蠟質(zhì)層的生物合成。從調(diào)控角度上講，擬南芥的表皮毛發(fā)育同根毛發(fā)育具有相同的機(jī)制，大部分由MYB-bHLH-WD40轉(zhuǎn)錄復(fù)合體調(diào)控著表皮毛的形成和分化[2]。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的離子通道、細(xì)胞骨架、微管和微絲的分布也在調(diào)控著表皮毛的發(fā)育。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中成員龐大的基因家族之一[3,4]。在這其中R2R3類(lèi)MYB基因則是整個(gè)MYB基因家族成員最多，這類(lèi)蛋白擁有兩個(gè)MYB repeat結(jié)構(gòu)域，因?yàn)楸幻麨镽2R3 MYB。R2R3 MYB基因家族成員在越來(lái)越多的物種有所報(bào)道，比如其中擬南芥中已發(fā)現(xiàn)超過(guò)198個(gè)MYB家族基因，而在棉花基因組中有200個(gè)MYB基因。功能研究表明，MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子參與了植物次生代謝物質(zhì)的調(diào)控、植物激素和環(huán)境因子應(yīng)答，同時(shí)在植物器官發(fā)育角度上看MYB基因在植物細(xì)胞的分化、細(xì)胞周期調(diào)控以及葉片等器官形態(tài)建成起到重要的作用。其中的group 9類(lèi)主要負(fù)責(zé)表皮細(xì)胞的形成和分化。這類(lèi)基因最早是在金魚(yú)草中報(bào)道的，它調(diào)控著金魚(yú)草花瓣表皮柱狀細(xì)胞的形成[5]。同時(shí)在金魚(yú)草中也同時(shí)存在著MIXTA基因的旁系同源基因即MIXTA-LIKE 1、MIXTA-LIKE 2和MIXTA-LIKE 3，他們都在金魚(yú)草花表皮細(xì)胞突起的形成過(guò)程中起到了關(guān)鍵性的作用，但是它們的功能并不冗余[6]。除了金魚(yú)草外，MIXTA基因控制植物表皮發(fā)育的功能已經(jīng)在大量植物中進(jìn)行了克隆及功能驗(yàn)證，他們包括楊樹(shù)、矮牽牛及樹(shù)石斛等[7-9]。在擬南芥中AtMYB106和AtMYB16通過(guò)不同的方式調(diào)控著擬南芥表皮毛的發(fā)育，其中AtMYB106和APETALA2/ETHYLENERESPONSE FACTOR(AP2/ERF),WAXES INDUCER1/SHINE1一起調(diào)控著擬南芥的角質(zhì)層形成，從而控制著擬南芥表皮毛的分布。最近通過(guò)群體遺傳學(xué)及二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合生物信息學(xué)分析方法對(duì)猴面花得EMS突變體進(jìn)行BSA（Bulk segregation analysis）群體分析后，也闡明了一個(gè)和蜜腺發(fā)育相關(guān)的MIXTA基因[10]。針對(duì)藥用植物表皮毛發(fā)育研究直接關(guān)系到藥用成分的合成以及分泌，通過(guò)對(duì)黃花蒿的表皮毛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的深入研究，一個(gè)名為AaMIXTA1的R2，R3-MYB類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子基因被成功克隆。通過(guò)超表達(dá)及RNAi實(shí)驗(yàn)證明，AaMIXTA1基因可以有效控制青蒿素的合成，這是由于其可以控制黃花蒿葉片表皮毛外表皮蠟質(zhì)合成基因的表達(dá)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)超表達(dá)AaMIXTA基因的黃花蒿品系并未使黃花蒿的表皮毛形態(tài)發(fā)生異形改變，同時(shí)又提高了青蒿素的含量，這為轉(zhuǎn)基因育種提供了更好的研究思路[11]。從基部真雙子葉植物唐松草中克隆得到的MIXTA-like2基因可以使轉(zhuǎn)基因煙草的表皮突起增加,驗(yàn)證了唐松草中MIXTA-like2基因的功能[12]。

淫羊藿為中國(guó)傳統(tǒng)中草藥之一，具有2000多年的悠久歷史。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，淫羊藿有“主陰痿絕傷，莖中痛，利小便，益氣力，強(qiáng)志”的功效?！度杖A子本草》則稱(chēng)淫羊藿“能治一切風(fēng)冷勞氣，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力，丈夫絕陽(yáng)不起，女子絕陰無(wú)子。筋骨攣急。四肢不任，老人昏耄，中年健忘”。它不僅具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，而且還兼有抗衰老、改善免疫功能、抑制腫瘤和抗骨質(zhì)疏松等功效，其有效成份主要為黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)。針對(duì)淫羊藿所開(kāi)展的調(diào)控研究已經(jīng)在MYB類(lèi)型的基因有所報(bào)道，比如EsMYBA1基因和EsAN2可以調(diào)控花青素的生成[13]，EsMYBF1可以調(diào)控黃酮醇的形成[14]，EsMYB9基因可以同時(shí)調(diào)控花青素和黃酮醇的形成[15]。

淫羊藿的花被從外至內(nèi)分別稱(chēng)之為外萼片、內(nèi)萼片和花瓣（距）。外萼片通常為紫色或綠色；外一對(duì)較小，卵狀長(zhǎng)圓形；內(nèi)一對(duì)較大，卵形或闊卵形，有時(shí)具白色邊。由于該屬外萼片較小，早落，種間差別不大，一般不作為分種的依據(jù)。內(nèi)萼片花瓣?duì)睿秸归_(kāi)或略反折，呈三角形、卵形、寬卵形或披針形；花瓣的形態(tài)也比較多樣化，呈瓣片狀、具長(zhǎng)距、具短距或囊狀等。內(nèi)萼片形態(tài)、花瓣（距）的形態(tài)及與二者的大小關(guān)系是最穩(wěn)定的形態(tài)性狀，在屬下分組和分種中具有重要的意義。本項(xiàng)研究以藥用植物箭葉淫羊藿作為研究對(duì)象，參考本草基因組的方法體系[16,17]，通過(guò)同源克隆的研究策略成功地對(duì)控制表皮毛發(fā)育相關(guān)基因EsMIXTA進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，為以后通過(guò)基因工程改造箭葉淫羊藿表皮發(fā)育，提高次生代謝產(chǎn)物的合成提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)試劑

大腸桿菌（Escherich coli）DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于全式金公司。Trizol RNA提取試劑及反轉(zhuǎn)酶Superscript III購(gòu)自于英偉創(chuàng)津公司（Invitrogen，China）；瓊脂糖凝膠試劑盒購(gòu)自于天根公司（Tiangen，China）；ExTaq酶、pMD19-T載體及熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑購(gòu)自于購(gòu)自于寶生物公司（Takara，Japan）。

2.2 RNA提取及cDNA第一條鏈合成

取箭葉淫羊藿的根、葉和花，在180-200℃烘烤過(guò)的研缽中用液氮將其充分研磨，迅速倒入無(wú)RNA酶的離心管中，待液氮揮發(fā)后，按1 mL試劑/100 mg材料的比例加入適量的Trizol反應(yīng)試劑（Invitrogen公司），并按照Trizol試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的提取?；?′端 獲 得 的 cDNA 合 成 以 3′CDS:5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3′為引物，而 5’端獲得的cDNA合成初始則需以引物5′CDS:和SMART II A oligo 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3作為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程參考Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)。

2.3 EsMIXTA基因的克隆

根據(jù)已有報(bào)道的唐松草中的MIXTA基因且簡(jiǎn)并引物作為正向引物[12]，以 UPM1:5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′和 UPM2：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′引物作為反向引物進(jìn)行EsMIXTA基因的3′端克隆。反應(yīng)體系：以2 μL的第一鏈cDNA為模板；2 μL正、反向引物（UPM）（10 μM）；5 μL 10×PCR 緩沖液；2 μL dNTP（2mM）；1 U ExTaq DNA聚合酶；用無(wú)菌去離子水將體系補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)減一度。94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。結(jié)果檢測(cè)：取PCR產(chǎn)物5 μL，電泳檢測(cè)，切膠回收，連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。在獲得正確的EsMIXTA基因的3′端后，以該序列作為候選序列，設(shè)計(jì)基因5′端的反向引物。EsMIXTA基因5′端的獲得；反應(yīng)體系同3′端基因的獲得，正向引物為UPM（10 μM）；反向引物為基因特異性引物。對(duì)EsMIXTA基因5′端及3′端進(jìn)行分析后設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物EsMIXTAFULF:ATGGGTCGATCACCGTGTGAT和EsMIXTAFULR:CAGGAGAACGGGAGGGAGAA。

2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

從-80℃超低溫冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上，加入5 μL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30 min。將含有感受態(tài)細(xì)胞和連接產(chǎn)物的離心管置于42℃恒溫水浴鍋中，熱激60 s，不要搖晃。然后，立即冰浴2 min。加入750 μL LB培養(yǎng)基，混勻，置于37℃搖床上，約150 rpm，培養(yǎng)45-60 min。4000 rpm，離心5 min。在含氨芐青霉素的 LB 平板上涂上 X-Gal（20mg·mL）40 μL，晾干。從離心后的離心管中吸去500 μL上清后，用剩余的上清液將菌體混勻，并加入IPTG（200mg/ml）20μl，涂于LB平板上。將平板于37℃培養(yǎng)12-16h。

2.5 EsMIXTA基因的表達(dá)模式

以箭葉淫羊藿根、葉、萼片、花瓣及雄蕊雌蕊混合材料為研究對(duì)象，用Trizol試劑盒提取總RNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit(Takara,Japan)進(jìn)行，第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄。在進(jìn)行PCR反應(yīng)前，將第一鏈cDNA稀釋10倍作為模板。然后利用SYBR?Premix Ex TaqTM II(Takara,Japan)反應(yīng)試劑盒，在型號(hào)為ABI7500的實(shí)時(shí)定量PCR儀上以引物EsMIXTRTF:5′-TAACGGAGCAGTCGAAAAGTGA-3′EsMIXTR:5′-CGGTGTCTCCACTACCGTCTG-3′來(lái)完成反應(yīng),并根據(jù)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法利用ABI7500軟件（基因有限公司）分析所獲得的數(shù)據(jù)并計(jì)算樣品中目的基因濃度。本實(shí)驗(yàn)所用的PCR反應(yīng)體系為20 μL，共設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)條件為40個(gè)循環(huán)，95°5 s、60°34 s。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

序列經(jīng)過(guò)EMBL網(wǎng)站MUSCLE在線(xiàn)軟件進(jìn)行比對(duì)，之后再通過(guò)Modeltest進(jìn)行最大似然法參數(shù)選擇計(jì)算，最終運(yùn)用MEGA 5.0中進(jìn)行最大似然樹(shù)（Maximum Likelihood）的構(gòu)建，自舉檢驗(yàn)（bootstrapvalue）為1000次。

2.7 花萼片和花瓣表面的掃描電鏡觀(guān)察

收集箭葉淫羊藿花萼片和花瓣立即進(jìn)行固定和處理材料，其中固定液為FAA或者戊二醛。將固定至少24小時(shí)以上的材料，經(jīng)不同濃度乙醇梯度脫水后轉(zhuǎn)入95%乙醇中，過(guò)夜。脫水：將剝出的材料轉(zhuǎn)入無(wú)水乙醇中，脫水20 min。此后，將材料相繼轉(zhuǎn)入75%乙醇+25%乙酸異戊酯；50%乙醇+50%乙酸異戊酯；25%乙醇+75%乙酸異戊酯；100%乙酸異戊酯中，每級(jí)20 min。二氧化碳臨界點(diǎn)干燥。將干燥好的原基材料在解剖鏡下用雙面膠粘在金屬臺(tái)上。在離子濺射儀上對(duì)粘好的金屬臺(tái)進(jìn)行噴金、鍍膜。掃描電鏡下觀(guān)察照相。

3 結(jié)果與分析

3.1 箭葉淫羊藿EsMIXTA基因的克隆與序列分析

經(jīng)克隆后測(cè)序獲得EsMIXTA基因的全長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)ORF search預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1163bp。經(jīng)過(guò)對(duì)EsMIXTA基因所編碼蛋白進(jìn)行Blastp的比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，EsMIXTA蛋白和唐松草Thalictrum thalictroide MIXTA基因MYBML2蛋白具有最大的相似度。通過(guò)對(duì)EsMIXTA蛋白與已有的MIXTA蛋白進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)EsMIXTA蛋白具有典型的R2 R3-MYB蛋白的結(jié)構(gòu)域，即N端含有典型的結(jié)構(gòu)域R2結(jié)構(gòu)域和R3結(jié)構(gòu)域，并擁有subgroup9的專(zhuān)屬結(jié)構(gòu)域（圖1）。在對(duì)MIXTA基因通過(guò)核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)重建后發(fā)現(xiàn)，EsMIXTA基因與唐松草中的MIXTA基因親緣關(guān)系較近（表1，圖2），由于唐松草屬和淫羊藿屬都隸屬于毛茛目，所以其基因的親緣關(guān)系較近符合進(jìn)化生物學(xué)觀(guān)點(diǎn)。

3.2 EsMIXTA基因在不同組織中的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示EsMIXTA基因在箭葉淫羊藿的根、葉及其花器官中均有一定的表達(dá)，其中根中EsMIXTA基因的相對(duì)表達(dá)最高，其次是葉片，相比根部和葉片，在花器官中該基因的表達(dá)明顯低（圖3）。

圖1 箭葉淫羊藿MIXTA基因編碼蛋白氨基酸與其他植物同源基因比對(duì)

表1 MIXTA類(lèi)基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)數(shù)據(jù)

通過(guò)對(duì)箭葉淫羊藿的花瓣?duì)钶嗥突ò甑纳舷螺S面進(jìn)行觀(guān)察，我們可以觀(guān)察到花萼片的上軸面具有明顯的凸起（圖4a），而花瓣的上軸面凸起并不明顯（圖4b）。從下軸面來(lái)看，花萼片的下軸面呈現(xiàn)出不規(guī)則的條紋狀突起（圖4c），而花瓣的下軸面則與上軸面形態(tài)類(lèi)似即矩形微突起（圖4d）。

圖2 通過(guò)ML（最大似然）算法對(duì)MIXTA類(lèi)基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)重建

4 討論

在本項(xiàng)研究中，我們通過(guò)反向遺傳學(xué)的手段在中藥箭葉淫羊藿中克隆得到了一個(gè)MYB基因，通過(guò)蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它含有保守氨基酸序列R2和R3兩個(gè)區(qū)域。同時(shí)該基因所編碼的蛋白質(zhì)擁有特殊性的subgroup9類(lèi)MYB特有的保守氨基酸基序，從而可以認(rèn)定該基因?qū)儆趕ubgroup9類(lèi)型的R2R3 MYB基因。從植物分子系統(tǒng)學(xué)角度看箭葉淫羊藿中的MIXTA基因和唐松草MIXTA基因聚成一支，它們都是basal core eudicot（基部真雙子葉類(lèi)型）物種，所以從進(jìn)化角度上講，EsMIXTA基因?yàn)門(mén)tMIXTA基因的直系同源基因。。

圖3 EsMIXTA基因在不同器官中的表達(dá)模式

圖4 箭葉淫羊藿萼片和花瓣上下軸面微形態(tài)。

從形態(tài)學(xué)角度來(lái)觀(guān)察，箭葉淫羊藿的萼片上表面表現(xiàn)出不規(guī)則的突起狀態(tài)，這一形態(tài)特征明顯大于花瓣上表面的細(xì)胞形態(tài)。由于箭葉淫羊藿的萼片呈現(xiàn)出大、且花瓣?duì)畹男螒B(tài)，而花瓣則呈現(xiàn)出囊狀的形態(tài)。這一類(lèi)淫羊藿明顯不同于像巫山淫羊藿等長(zhǎng)距類(lèi)型，我們認(rèn)為箭葉淫羊藿中的萼片可能起到了招引傳粉者的關(guān)鍵作用，當(dāng)然這個(gè)假設(shè)需要得到繁殖生物學(xué)的證據(jù)。從我們的表達(dá)數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)EsMIXTA基因在箭葉淫羊藿的各個(gè)器官中都有所表達(dá)，這一結(jié)果和之前報(bào)道過(guò)的金魚(yú)草[6]、矮牽牛[7]和唐松草[12]的結(jié)果類(lèi)似，這表明EsMIXTA基因很有可能調(diào)控著細(xì)胞突起這一形態(tài)特點(diǎn)，使得箭葉淫羊藿的萼片呈現(xiàn)出花瓣?duì)畹男螒B(tài)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)EsMIXTA基因在根中的表達(dá)量高，這可能和根毛形成有著密切的聯(lián)系。深入的研究需要通過(guò)本物種的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)或者異源表達(dá)去驗(yàn)證EsMIXTA基因在箭葉淫羊藿中的功能。