陳揚波，卞杰松，劉彩霞，湯鑫鑫

（1.湘南學院化學生物與環(huán)境工程學院/湘南稀貴金屬化合物及其應(yīng)用湖南省重點實驗室，湖南 郴州 423000）

【研究意義】化肥的廣泛使用在一定程度上促進了作物的生長，但是不應(yīng)該低估對土壤和環(huán)境的危害，化肥的大量使用導致土壤板結(jié)，減少了土壤有機質(zhì)含量和有益微生物數(shù)量［1］，導致農(nóng)作物產(chǎn)量減少，又因為化肥中氮含量過高，使得農(nóng)作物中NO3-、NO2-等離子濃度增加，對人畜會產(chǎn)生很大的毒害作用［2］。而生物有機肥是將家禽糞便、植物秸稈等通過無公害處理再往其中加入各種微生物菌種，因此微生物是生物有機肥的核心部分，微生物肥料具有增加微生物的數(shù)量，提升土壤中有機質(zhì)的含量，提高土壤營養(yǎng)成分等優(yōu)點［3］；許多功能微生物能顯著改善土壤理化性質(zhì)，調(diào)節(jié)生態(tài)平衡［4］；微生物的一些代謝產(chǎn)物也能增強作物對惡劣環(huán)境的適應(yīng)性，微生物產(chǎn)生的抗生素能夠?qū)Υ蠖鄶?shù)有害菌產(chǎn)生拮抗作用［5］；使得最終的農(nóng)作物風味也會得到極大的改善［6］。通過實驗研究了解生物有機肥中具體成分，完善生物肥料的作用機制，為生物有機肥的發(fā)展提供部分理論基礎(chǔ)。

【前人研究進展】微生物肥料已經(jīng)有百余年歷史，國際上最早使用的是由根瘤菌組成的生物肥料，我國在20世紀40年代才開始研究微生物肥料，最初都是在肥料中加入根瘤菌而成［7］；50年代早期逐漸在其中加入更多菌種，如固氮菌、磷細菌等；60年代開始使用添加了放線菌的“5406”微生物菌肥；70年代中期開始研發(fā)泡囊-叢枝菌根（AM菌根）［8］?？梢?，我國微生物肥料經(jīng)歷了3次發(fā)展，但都沒有延續(xù)過長的時間，由于當時缺乏這方面的監(jiān)管，各品種良莠不齊，沒有一個適合的標準［9］。在20世紀90年代和21世紀初，當時化肥大量使用，導致環(huán)境破壞嚴重，大家又重新將目光放到生物肥料上來?！颈狙芯壳腥朦c】目前微生物肥料發(fā)展迅速，所能添加的微生物已有數(shù)十種，生物有機肥逐漸從單一變得復雜，其功能也越來越多［10］，現(xiàn)在我國提倡發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)，而生物肥正是安全，無污染的肥料，我國幅員遼闊，耕地面積廣，今后生物肥料必定會有廣闊的前景［11］?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究主要從3個部分進行，分別為微生物分離與鑒定、探究菌種間的拮抗實驗、各菌種都適合生長的液體培養(yǎng)基的配制。希望通過此次對生物有機肥的研究，能為后續(xù)微生物肥料的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年10月至2019年1月在湘南學院化學生物與環(huán)境工程學院實驗樓進行。

1.1.1 供試菌種 供試各菌種都分離自生物有機肥肥料，生物有機肥購自郴州市同興南生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.5。液體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1 000 mL。兩種培養(yǎng)基均經(jīng)過高壓蒸汽滅菌30 min后使用。

1.1.3 主要設(shè)備 分析天平、超凈工作臺、電熱鼓風干燥箱、光學顯微鏡、可見分光光度計、酶標儀、高壓蒸汽滅菌鍋、高速冷凍離心機，pH酸度計、恒溫搖床、打孔器、培養(yǎng)皿、冰箱、電磁爐。

1.2 細菌鑒定

1.2.1 形態(tài)觀察 將生物有機肥樣品進行梯度稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，得到4種菌落，將其編號為CZ1、CZ2、CZ3、CZ4。挑取單個菌落進行純化，然后采用平板劃線法觀察單個菌落形態(tài)［12］。菌體形態(tài)觀察采用革蘭氏染色法，參照文獻［13］的步驟。

1.2.2 分子生物學鑒定 DNA提取參照文獻［14］的步驟。PCR擴增：以提取出來的細菌基因組DNA為模板，采用引物R-F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和R-R（TACGGCTACCTTGTTACGACGACTT）進行特異性擴增。引物購買于武漢擎科測序公司，所用的50 μL PCR反應(yīng)體系包括：基因組DNA 2 μL；引物R-F（10 μmol/L）2 μL；引物R-R（10 μmol/L）2 μL；TaqDNA 聚合酶 25 μL；加 H2O 至 50 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min。PCR完成后將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測［15］。

PCR產(chǎn)物鑒定：將電泳檢測后的PCR產(chǎn)物進行測序，獲得16SrDNA基因序列，測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information, NCBI）進行分析比對，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，導出相關(guān)菌株的16SrDNA基因序列，與實驗菌株一起用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［16］。

1.3 拮抗試驗

研究菌種間的拮抗關(guān)系采用菌餅法［17］，具體操作步驟如下：用接種環(huán)分別制作上述4種菌懸液，然后用移液管分別吸取0.5 mL于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上并用涂布器涂抹均勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，然后用1 cm的打孔器在已培養(yǎng)2 d的4種培養(yǎng)基上制取多塊菌餅，然后將該菌餅放置在剛涂布有另一種菌的平板上，放置3塊，并在培養(yǎng)基上放一塊無菌餅塊作對照［18］。試驗設(shè)計見表1。

表1 各菌種間拮抗實驗設(shè)計Table 1 Experimental design of antagonism among various strains

1.4 液體菌劑構(gòu)建

將牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的初始pH調(diào)節(jié)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，并將4種菌按1∶1∶1∶1的比例分別接種于不同pH的液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)48 h，然后通過稀釋涂布平板法測定有效活菌數(shù)。選擇菌種長勢較好的pH值作為該混合菌種的最適pH值［19］。

圖1 各菌種菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of various stains

圖2 各菌種菌體形態(tài)Fig.2 Morphology of various stains

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌鑒定

2.1.1 形態(tài)觀察 通過平板劃線法觀察到單個的菌落，其形態(tài)特征如下：CZ1，菌落粗糙，不透明，粘著，擴展，邊緣粗糙；CZ2，菌落表面粗糙，不透明，污白色或微黃色，邊緣整齊；CZ3，菌落呈白色或微黃色，表面光滑，邊緣整齊；CZ4，菌落凸起，微白色，濕潤，邊緣整齊，菌落背面為黃色（圖1）。

菌體形態(tài)通過革蘭氏染色法以及顯微鏡觀察，結(jié)果見圖2。在油鏡下觀察到的菌體形態(tài)特征如下：CZ1，有芽孢，無莢膜，不成鏈能運動，革蘭氏染色呈紫色，細胞直徑為0.6～0.9 μm×1.0～1.5 μm；CZ2，有芽孢，無莢膜，周生鞭毛，能運動，革蘭氏染色呈紫色，細胞直徑為0.7～0.8 μm×2～3 μm；CZ3，有芽孢，菌體末端圓，單個或呈短鏈排列，革蘭氏染色呈紫色，細胞直徑為 1.2～1.5 μm×2.0～4.0 μm；CZ4，無芽孢，菌體形態(tài)呈直或彎的桿狀單個、成對或呈鏈狀排列，革蘭氏染色呈紫色，細胞直徑為0.9～1.2 μm×3.0～8.0 μm。鏡檢發(fā)現(xiàn)4種細菌的顏色都為紫色，說明4種菌均為革蘭氏陽性菌。

2.1.2 分子生物學鑒定 通過16SrDNA基因序列同源性比對，構(gòu)建4種細菌的系統(tǒng)發(fā)育進化樹見圖3。從圖3可以看出，CZ1與地衣芽孢桿菌屬（B.licheniformis）同源性達100%，CZ2與枯草芽孢桿菌屬（B.subtilis）同源性達100%，CZ3與巨大芽孢桿菌屬（B.megaterium）同源性達100%，CZ4與植物乳桿菌屬（L.plantarum）同源性達100%。因此可以確定CZ1為地衣芽孢桿菌，CZ2為枯草芽孢桿菌，CZ3為巨大芽孢桿菌，CZ4為植物乳桿菌。

圖3 4種菌的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree for 16SrDNA sequences of four species of bacteria

2.2 各菌種間的拮抗作用

試驗采用C值表示抑菌作用的大小，C值是指抑菌圈直徑與菌餅直徑的比值，地衣芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌有拮抗作用，它們的C值分別為1.18和1.15；枯草芽孢桿菌對巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌有拮抗作用，它們的C值分別為1.12和1.19；巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌對其他菌種均無拮抗作用。

由圖4可知，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌均用同一種培養(yǎng)基培養(yǎng)，對營養(yǎng)物質(zhì)需求基本一致，但由于試驗中地衣芽孢桿菌已先在培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，因此數(shù)量上會有一定的優(yōu)勢，在營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間等的競爭上會占據(jù)一定的優(yōu)勢，從而對枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌產(chǎn)生一定的抑制作用；同樣的，枯草芽孢桿菌已先在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2 d，因此枯草芽孢桿菌的數(shù)量會比巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌多一些，在營養(yǎng)物質(zhì)、生長空間等的競爭中取得一定的優(yōu)勢，從而對巨大芽孢桿菌和枯草植物乳桿菌的生長產(chǎn)生一定的抑制效果，而且對于植物乳桿菌而言，枯草芽孢桿菌對其抑制作用較大，可能是因為枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物對植物乳桿菌的生長產(chǎn)生一定的抑制作用；其他菌種之間均無拮抗作用，因為C值均為1，它們可以共同生長。

圖4 各菌種拮抗試驗結(jié)果Fig.4 Result of antagonistic test of various strains

2.3 液體菌劑的構(gòu)建

2.3.1 pH對混合菌種生長的影響 按地衣芽孢桿菌∶枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶1∶1的比例混合接種在不同pH的液體培養(yǎng)基中，用稀釋涂布平板法測定有效活菌數(shù)，結(jié)果見表2。從表2可以看出，當培養(yǎng)基pH為7.0時，各菌種均生長良好，有效活菌數(shù)比其他pH下明顯要多，說明該混合菌劑的最適pH為7.0。因此，使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，將pH調(diào)至7.0，從而得到一種高效的液體菌劑。

表2 不同pH液體培養(yǎng)基中的有效活菌數(shù)（×108個/mL）Table 2 Number of effective living bacteria in liquid media with different pH (×108 cell/ mL)

3 討論

生物有機肥為當下較熱門的問題，搞清楚其中的菌種刻不容緩。本試驗經(jīng)過菌體、菌落、分子手段三方面的鑒定，力求能做到精確，在清楚其中菌種類型之后，考慮到可以配置液體菌劑，且這種菌劑比固體生物有機肥有益生菌數(shù)量多、效力強等優(yōu)點，通過拮抗實驗檢測各菌種之間的共存關(guān)系，表明這4種菌之間均無拮抗作用，可以共同生長，這為構(gòu)建液體菌劑提供了一個極好的理論基礎(chǔ)。液體菌劑要求菌種數(shù)量要足夠多，同時也需要各菌種較均衡，不能一枝獨秀，由于這4種菌都屬于細菌，因此選擇牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基作為實驗環(huán)境。影響液體菌劑構(gòu)建的因素包括pH、營養(yǎng)成分、菌種初始比例等，本試驗中牛肉膏蛋白胨的成分是一致的，而不同菌種的最適pH不同，混合培養(yǎng)時的最適pH更加值得探究，因此pH是最主要的一個影響因素，在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中添加其他營養(yǎng)成分對混合微生物生長的影響會在今后的試驗中加以研究。通過菌餅法證實沒有拮抗，因此采用地衣芽孢桿菌∶枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶1∶1的比例進行最適pH的測定。對各菌懸液進行吸光度測試，保證初始菌種數(shù)量基本一致，避免因某種菌數(shù)量過多而影響其他菌生長發(fā)育。生物有機肥的具體作用機制目前尚未明朗，可以肯定其具有巨大的發(fā)展前景，應(yīng)更深入其作用機理研究，完善科研手段和科研設(shè)備，增加微生物肥料的種類，更大限度提高農(nóng)作物產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本試驗從生物有機肥中分離出4種菌，經(jīng)鑒定分別為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌。通過菌餅法和平板涂布法對各菌種之間的拮抗作用以及培養(yǎng)條件進行研究，表明這4種菌之間均無拮抗作用，雖然地衣芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌有拮抗作用（C值分別為1.18和1.15），枯草芽孢桿菌對巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌也有拮抗作用（C值分別為1.12和1.19），但C值均小于1.2，因此將它們之間的拮抗忽略不計，因為菌餅上的菌已培養(yǎng)生長了2 d，在數(shù)量上有一定的優(yōu)勢，會由于數(shù)量的差異而產(chǎn)生一定的抑菌作用，所以忽略不計。巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌對其他菌種均無拮抗作用。

由于這4種菌之間均無拮抗作用，將地衣芽孢桿菌∶枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶植物乳桿菌按1∶1∶1∶1添加到不同pH的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并用稀釋涂布平板法測定有效活菌數(shù)，最終得到最適pH為7.0，即使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，將pH調(diào)至7.0時各菌種都能很好的的生長，由此可得到一種高效的液體菌劑。