胡倩梅 楊會(huì)會(huì) 朱華玉 胡建斌 楊路明

摘? ? 要： 為尋找調(diào)控果面茸毛、果面溝以及果面瘤表型變異的位點(diǎn)，調(diào)查200份甜瓜種質(zhì)在2017年和2018年的表型，并對(duì)這200份種質(zhì)進(jìn)行全基因組重測(cè)序，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法對(duì)其進(jìn)行關(guān)聯(lián)。結(jié)果在3號(hào)染色體上找到了一個(gè)與果面茸毛顯著相關(guān)的SNP;在11號(hào)染色體上找到了2個(gè)與果面溝顯著相關(guān)的SNP，在5號(hào)、7號(hào)和11號(hào)染色體上各找到了一個(gè)與果面溝深顯著相關(guān)的SNP;在12條染色體上均找到了與果面瘤顯著相關(guān)的SNP，所有與果面瘤顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記中有8個(gè)標(biāo)記顯著性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他標(biāo)記。進(jìn)一步對(duì)果面茸毛的1個(gè)顯著SNP，果面溝的5個(gè)顯著SNP和果面瘤的8個(gè)SNP進(jìn)行了基因注釋?zhuān)灿?jì)找到了146個(gè)基因。研究結(jié)果有助于甜瓜果面茸毛、果面瘤以及果面溝性狀的快速精細(xì)定位，也將為甜瓜果實(shí)遺傳改良提供重要參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 甜瓜;果面茸毛;果面溝;果面瘤;全基因組關(guān)聯(lián)分析

Genome-wide association analysis of fruit fluff， fruit surface tumor and fruit surface ditch in melon

HU Qianmei1， YANG Huihui1， ZHU Huayu1，2， HU Jianbin1，2， YANG Luming1，2

（1.College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： Based on the phenotyping and re-sequencing of 200 melon germplasms， the genome-wide association analysis was used to identify loci associated with fruit villi， fruit sulcus， and fruit surface tumors in melon. These traits were investigated of 200 melon germplasms in 2017 and 2018， and genome-wide resequencing of these 200 germplasms was conducted for SNP detection. As a result， 1 SNP was found on chromosome 3 that was significantly associated with fruit fluff. 2 SNPs were found on chromosome 11 that were significantly associated with the fruit surface ditch. There was only 1 SNP was found significantly associated with the fruit surface ditch on the chromosome 5， 7 and 11， respectively. SNPs that were significantly associated with fruit surface tumors were found on all 12 chromosomes. Among of them， 8 SNPs had much higher significantly associated than the other SNPs， therefore those SNPs were used in further study. Totally 14 SNPs were detected associated for fruit villi， fruit sulcus， and fruit surface tumors， and 146 genes flanking these SNP were annotated. The SNPs significantly associated withthese traits will be helpful to quickly and finely locate candidate genes， and will also provide an important reference for the genetic improvement of melon fruit.

Key words： Melon; Fruit fluff; Fruit groove; Fruit surface tumor; Genome-wide association analysis

甜瓜（Cucumis melo L.）為葫蘆科（Cucurbitaceae）作物，染色體數(shù)為2n=2x=24。甜瓜屬于喜溫、喜光植物，在28～32 ℃范圍內(nèi)可以正常生長(zhǎng)，低于13 ℃即停止生長(zhǎng)[1]。甜瓜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，是世界十大水果之一。甜瓜自身的表型多樣性極其豐富，不同類(lèi)型的甜瓜在果面茸毛、果面瘤、果面溝、果皮顏色、果肉顏色、瓜瓤顏色、種子顏色、果面網(wǎng)紋、可溶性固形物含量、葉片形狀等諸多方面有很大的差異，其多樣性在葫蘆科植物中僅次于南瓜。2012年甜瓜全基因組測(cè)序結(jié)果公布，基因組大小為454 Mb，預(yù)測(cè)共有27 427個(gè)基因[2]，為開(kāi)展甜瓜分子育種研究提供了極大的便利。在過(guò)去的十幾年間大量的研究工作者對(duì)甜瓜的果皮顏色、果面覆紋、果肉顏色、果肉含糖量、果實(shí)質(zhì)量、果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)寬度、果肉厚度、葉面積、葉片缺刻、種子寬度、種子長(zhǎng)度以及種子質(zhì)量[3-14]等農(nóng)藝性狀做了深入研究，然而對(duì)成熟果實(shí)的茸毛自然脫落、果面瘤和果面溝所做的研究還相對(duì)較少。

果面茸毛是指果實(shí)成熟后果皮表面的茸毛，與先前Palomares-Rius等[15]所研究的TypeⅠ型茸毛以及Zhu等[16]所研究的無(wú)毛突變體均不同。果面瘤是指成熟果實(shí)表面的瘤狀物凸起，先前研究中多認(rèn)為該性狀是由環(huán)境引起的，但筆者在研究中發(fā)現(xiàn)部分材料較易產(chǎn)生果面瘤，而部分材料則不易產(chǎn)生果面瘤;果面溝指成熟果實(shí)表面的凹陷，我們一般將果面溝分為果面溝有無(wú)、果面溝淺和果面溝深這3個(gè)性狀，果面溝影響甜瓜的果皮結(jié)構(gòu)、果實(shí)受力以及裂果，王學(xué)征等[17]通過(guò)構(gòu)建6世代定位到1個(gè)與果面溝形成相關(guān)的基因。

全基因組關(guān)聯(lián)分析（ GWAS）是指在全基因組范圍內(nèi)，通過(guò)高密度的SNP標(biāo)記挖掘控制表型性狀變異基因座的統(tǒng)計(jì)分析方法。關(guān)聯(lián)分析的方法最早應(yīng)用于人類(lèi)相關(guān)疾病case-control研究中[18]，受人類(lèi)疾病遺傳學(xué)研究的啟示，GWAS也被運(yùn)用到作物遺傳和育種研究中并取得重要進(jìn)展[19-20]，本研究通過(guò)對(duì)200份甜瓜種質(zhì)進(jìn)行重測(cè)序，利用 GWAS的方法對(duì)成熟果實(shí)果面茸毛的脫落、果面瘤、果面溝有無(wú)、果面溝淺以及果面溝深這5個(gè)性狀進(jìn)行研究，以期能夠找到真正造成表型變異的突變位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來(lái)自于從世界各地收集的200份甜瓜種質(zhì)，包括88份厚皮種質(zhì)，91份薄皮種質(zhì)和21份野生種質(zhì)，其中11份種質(zhì)由胡建斌收集，77份種質(zhì)來(lái)源于美國(guó)農(nóng)業(yè)部，112份種質(zhì)來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)所。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn) 本研究田間試驗(yàn)于2017年、2018年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)毛莊試驗(yàn)基地的塑料大棚進(jìn)行。2月中旬進(jìn)行溫湯浸種催芽，材料播種于72孔穴盤(pán)，在日光溫室中進(jìn)行育苗。所有材料3葉1心時(shí)進(jìn)行定植，每年設(shè)置2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)內(nèi)每份材料定植4個(gè)單株。田間水、肥以及整枝按照常規(guī)管理。所有材料于果實(shí)成熟時(shí)期進(jìn)行性狀調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參考《甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[21]的標(biāo)準(zhǔn)與方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分級(jí)和賦值。

1.2.2 測(cè)序樣品制備 植株定植30 d后，采用混合采樣法，每個(gè)材料混合采取4個(gè)單株的幼嫩葉片3～5 g，采用真空冷凍干燥器將葉片抽干，并用高通量組織粉碎機(jī)將葉片打磨成粉末狀備用。提取總DNA，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 全基因組重測(cè)序 200份甜瓜種質(zhì)的測(cè)序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成，采用Illumina測(cè)序技術(shù)。測(cè)序完成后過(guò)濾掉帶接頭的reads、N含量超過(guò)10%的reads以及質(zhì)量值低于10的堿基超過(guò)50%的reads。

1.2.4 SNP標(biāo)記的檢測(cè)與篩選 采用GATK（V4.0.9.0）call SNP[22]，將雙端read和單端read都作為 call SNP的初始reads數(shù)據(jù)。

1.2.5 群體遺傳學(xué)分析 應(yīng)用利用GCTA （V1.91.2）進(jìn)行主成分分析，保留前3個(gè)特征向量，以其作為協(xié)變量放入全基因組關(guān)聯(lián)分析模型中[23];利用GAPIT進(jìn)行親緣關(guān)系分析親緣關(guān)系矩陣（K）[24]作為隨機(jī)效應(yīng)加入到全基因組關(guān)聯(lián)分析模型中;LD值由PopLDdecay（V3.40）進(jìn)行計(jì)算，用r?值來(lái)確定LD衰減距離。

1.2.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析 為減弱性狀的復(fù)雜性對(duì)關(guān)聯(lián)結(jié)果的影響，除去果面茸毛和果面瘤外，我們將果面溝分為果面溝有無(wú)、果面溝淺和果面溝深進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。本研究利用GAPIT中的一般線性模型（GLM）、混合線性模型（MLM）、壓縮混合線性模型（CMLM）和多位點(diǎn)混合線性模型（MLMM）4個(gè)模型同時(shí)對(duì)5個(gè)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)，利用BH矯正進(jìn)行篩選顯著SNP，將同時(shí)在 5個(gè)模型中關(guān)聯(lián)到的SNP標(biāo)記進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.7 SNP注釋 根據(jù)公布的甜瓜基因組CM3.6.1_pseudomol.fa （V3.6.1）和注釋文件CM4.0.gff3（V4.0）對(duì)獲得的全基因組SNP進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組重測(cè)序與SNP標(biāo)記過(guò)濾

200份甜瓜種質(zhì)的全基因組重測(cè)序共計(jì)獲得1 849 Gb的clean測(cè)序數(shù)據(jù)，平均測(cè)序深度為22 X。通過(guò)GATK對(duì)SNP的過(guò)濾，共計(jì)獲得2 989 591個(gè)SNP標(biāo)記。

2.2 連鎖不平衡分析

通過(guò)對(duì)200份種質(zhì)材料進(jìn)行LD衰減分析（圖1），結(jié)果表明群體衰減距離為60 kb，將在檢測(cè)到的顯著SNP前后30 kb分析候選基因[25]。

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析能夠通過(guò)計(jì)算每個(gè)SNP位點(diǎn)與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的可信值，從而對(duì)調(diào)控目標(biāo)性狀的位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，筆者通過(guò)對(duì)果面茸毛、果面瘤、果面溝有無(wú)、果面溝淺和果面溝深這5個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行GLM、MLM、CMLM和MLMM等4種關(guān)聯(lián)模型全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)果面茸毛有1個(gè)SNP（圖2-A），位于3號(hào)染色體;果面瘤檢測(cè)到了105個(gè)SNP（圖2-B）在12條染色體均有分布;果面溝有無(wú)檢測(cè)到了2個(gè)SNP（圖2-C），位于11號(hào)染色體;果面溝淺沒(méi)有檢測(cè)到SNP（圖2-D），果面溝深檢測(cè)到3個(gè)SNP（圖2-E），分別位于5號(hào)、7號(hào)和11號(hào)染色體。其中果面溝有無(wú)和果面溝深均檢測(cè)到了標(biāo)記chr11_24130439，果面瘤檢測(cè)到的顯著SNP中chr7_8087384、chr8_10804573、chr12_19247259、chr7_21474816、chr4_32540139、chr4_3278835、chr9_23361283和chr2_9400335這8個(gè)SNP的顯著性最高，其P值分別為1.16E-53、1.80E-53、2.23E-47、1.96E-45、1.12E-37、6.33E-29、5.69E-24和1.16E-20，基于此對(duì)SNPs的注釋中針對(duì)果面瘤我們著重研究這8個(gè)顯著性最高的SNP（表1）。

2.4 SNP的注釋

基于甜瓜基因組注釋在14個(gè)SNP上下游區(qū)域30 kb測(cè)到146個(gè)基因，果面茸毛獲得10個(gè)相關(guān)基因，果面溝有無(wú)獲得14個(gè)基因，果面溝深獲得33個(gè)基因，果面瘤獲得89個(gè)基因。經(jīng)比對(duì)分析我們發(fā)現(xiàn)在果面瘤茸毛顯著SNP標(biāo)記chr3_256240260附近檢測(cè)到的基因MELO3C011492.2和纖維素的分解、膜的組成以及纖維素酶的活性均有關(guān)聯(lián);與果面溝顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記chr11_24130439附近檢測(cè)到基因MELO3C019697.2和細(xì)胞的組成部分以及伸長(zhǎng)相關(guān)，標(biāo)記chr05_24592367附近檢測(cè)到基因MELO3C004136.2能夠調(diào)控細(xì)胞的單方向生長(zhǎng)，標(biāo)記chr07_2180656附近的基因MELO3C016777.2對(duì)分生組織的生長(zhǎng)和纖維素微纖維組織均有調(diào)控作用;與果面瘤相關(guān)的SNP標(biāo)記chr4_3278835附近的基因MELO3C003679.2和細(xì)胞質(zhì)的組成成分相關(guān)。

3 討 論

3.1 甜瓜全基因組關(guān)聯(lián)分析

自2012年甜瓜基因組序列發(fā)表以來(lái)，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法研究甜瓜相關(guān)性狀的研究也相繼發(fā)表，但其在甜瓜中的應(yīng)用還比較薄弱，所用標(biāo)記和關(guān)聯(lián)的性狀均較少。2015年齊振宇[9]利用14 689個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)構(gòu)建的F2群體的6個(gè)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在1號(hào)和10號(hào)染色體檢測(cè)到與節(jié)間長(zhǎng)度相關(guān)的SNP位點(diǎn)，在1、4和8號(hào)染色體檢測(cè)到與側(cè)枝長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，在1、3、4、8、11和12號(hào)染色體檢測(cè)到與葉面積相關(guān)的SNP位點(diǎn)，在10號(hào)染色體檢測(cè)到與果皮顏色相關(guān)的SNP位點(diǎn)，在2號(hào)染色體上檢測(cè)到與甜瓜抗白粉病相關(guān)的SNP。2016年Nimmakayala等[26]利用13 756個(gè)SNP標(biāo)記通過(guò)GWAS和QTL連鎖作圖相互驗(yàn)證的方法將甜瓜果肉硬度定位到6、8、9、11和12號(hào)染色體。2017年王艷玲等[27]利用104個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)果實(shí)相關(guān)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，將果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、果形指數(shù)、果肉厚度和果實(shí)鮮質(zhì)量分別關(guān)聯(lián)到10、5、9、8和10個(gè)SSR標(biāo)記。本研究所用SNP標(biāo)記數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以上研究在甜瓜全基因組關(guān)聯(lián)分析中所用的標(biāo)記數(shù)，研究中所關(guān)聯(lián)的性狀還未發(fā)現(xiàn)有學(xué)者對(duì)其用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法研究過(guò)，本研究豐富了甜瓜在全基因組關(guān)聯(lián)分析方面的研究。

3.2 關(guān)聯(lián)模型比較

Q-Q圖可以通過(guò)判斷圖形中的點(diǎn)分布是否合理，進(jìn)而推斷出所用的統(tǒng)計(jì)模型是否合理。一般Q-Q圖有兩種比較合理的模型，第1種是觀測(cè)值與期望值相同，第2種是Q-Q圖的左下角期望值與觀測(cè)值一致，右上角有少量位點(diǎn)高高翹起，超過(guò)期望值。第1種表明沒(méi)有找到與性狀顯著相關(guān)的SNP，第2種是在進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析中所期望得到的關(guān)聯(lián)結(jié)果，左下角期望值與觀測(cè)值一致表明了模型的合理性，右上角少量標(biāo)記超出了期望值，表明對(duì)所關(guān)聯(lián)性狀關(guān)聯(lián)到了與性狀顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記。筆者同時(shí)應(yīng)用了4種關(guān)聯(lián)模型，由本研究中的5個(gè)性狀結(jié)果圖可以看出一般線性模型和混合線性模型均有大量的標(biāo)記觀測(cè)值高于期望值，顯然這是不符合生物學(xué)邏輯的。而壓縮混合線性模型和多位點(diǎn)混合線性模型從Q-Q圖上來(lái)看一方面比較符合生物學(xué)邏輯，另一方面這兩個(gè)模型的一致性比較高，從側(cè)面驗(yàn)證的檢測(cè)到的顯著性標(biāo)記具有較高的可信度。

3.3 關(guān)聯(lián)結(jié)果

果面茸毛、果面瘤以及果面溝是影響甜瓜外觀品質(zhì)和商業(yè)品質(zhì)的重要因素，定位調(diào)控果面茸毛、果面瘤以及果面溝的基因位點(diǎn)可以揭示這3類(lèi)性狀的遺傳機(jī)制，為利用分子育種技術(shù)培育外觀品質(zhì)和商業(yè)品質(zhì)優(yōu)異的新品種奠定基礎(chǔ)。目前關(guān)于甜瓜茸毛的報(bào)道僅有2篇，Palomares-Rius等[15]所研究的Type I型茸毛主要表現(xiàn)為茸毛短小，且主要是對(duì)葉片的研究，Zhu等[16]所研究的無(wú)毛突變體在整個(gè)生育期整個(gè)植株上均表現(xiàn)為無(wú)毛，而本研究的果面茸毛僅在果實(shí)成熟期開(kāi)始脫落，基于該性狀對(duì)果實(shí)幼果的保護(hù)，是一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀，目前尚且沒(méi)有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究，筆者在200份甜瓜種質(zhì)中關(guān)聯(lián)到的位點(diǎn)（chr3_25624260）與前兩位學(xué)者所關(guān)聯(lián)到的位點(diǎn)（11號(hào)染色體和8號(hào)染色體）完全不同，說(shuō)明這些性狀是由不同位點(diǎn)控制的。王學(xué)征等[17]將果面溝QTL_qGroove-1-1定位到11號(hào)染色體末端的1.1 cM的區(qū)間內(nèi)，這與本研究中關(guān)于果面溝所檢測(cè)到11號(hào)染色體上的SNP標(biāo)記比較接近，同時(shí)我們?cè)?號(hào)的7號(hào)染色體發(fā)現(xiàn)了新的和果面溝顯著相關(guān)的位點(diǎn)，可能果面溝并不是一個(gè)簡(jiǎn)單的質(zhì)量性狀，推測(cè)其可能是由多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控的數(shù)量性狀，這與王學(xué)征等[17]所認(rèn)為的果面溝是由一對(duì)等位基因調(diào)控的結(jié)果所不同。甜瓜果面瘤的性狀目前還沒(méi)有學(xué)者進(jìn)行研究。盡管本研究檢測(cè)到了156個(gè)與表型顯著相關(guān)的SNP，但沒(méi)有對(duì)所檢測(cè)到的SNP附近基因進(jìn)行定量分析，無(wú)法確定所獲得的標(biāo)記附近基因?qū)Ρ硇偷恼{(diào)控模式，仍需后續(xù)研究對(duì)其進(jìn)行深入分析研究。

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