■唐 峰 吳代武 葉元土 李雪梅 顏建波 胡銀雅 李權(quán)珍 張 燕

（1.浙江豐宇海洋生物制品有限公司，浙江舟山316000；2.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215123）

魚(yú)粉生產(chǎn)過(guò)程中，原料魚(yú)經(jīng)蒸煮、壓榨得到榨汁和榨餅（固形物），榨汁經(jīng)油水分離，得到初級(jí)魚(yú)油和魚(yú)蛋白水。我國(guó)魚(yú)粉年產(chǎn)量30多萬(wàn)噸，每生產(chǎn)1噸魚(yú)粉，大約產(chǎn)生2～3 噸榨汁[1]。早期的魚(yú)粉生產(chǎn)企業(yè)常常將榨汁作為魚(yú)粉加工廢水直接排放到環(huán)境中，這在一定程度上造成資源浪費(fèi)、環(huán)境污染[2]。部分企業(yè)將榨汁或魚(yú)蛋白水濃縮回收生產(chǎn)全脫、半脫魚(yú)粉，但榨汁的鹽分、雜質(zhì)含量高，新鮮度差，影響魚(yú)粉質(zhì)量[3]。因此，利用魚(yú)蛋白水開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品是解決魚(yú)粉加工廢水處理難題的有效方法。

近幾年，少數(shù)企業(yè)嘗試以魚(yú)蛋白水為原料濃縮得到魚(yú)溶漿。魚(yú)溶漿富含水溶性蛋白質(zhì)、小肽、游離氨基酸等[4-5]，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物具有一定的誘食性[6]，但有害成分（如生物胺、T-VBN）含量也較高，不利于魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)[7-8]。水解魚(yú)蛋白水制備酶解魚(yú)溶漿，水溶性生物活性成分含量較魚(yú)溶漿顯著升高，其生物學(xué)價(jià)值也得到較大的改善，這在部分養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)已得到驗(yàn)證[8]。目前對(duì)酶解魚(yú)溶漿水解工藝條件的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究以青占魚(yú)蛋白水為原料制備酶解魚(yú)溶漿，篩選適合的蛋白酶，并確定最佳酶解條件優(yōu)化水解工藝。

1 材料方法

1.1 原料與試劑

實(shí)驗(yàn)用青占魚(yú)蛋白水取自浙江豐宇海洋生物制品有限公司魚(yú)粉生產(chǎn)線。

復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶購(gòu)自安琪酵母股份有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫?cái)嚢杷″仯℉H-2，常州歐邦電子有限公司）；消化爐（KDN-08，深圳市五創(chuàng)興電子科技有限公司）；自動(dòng)定氮儀（KDN-103A，上海纖檢儀器有限公司）；全自動(dòng)氨基酸分析儀（LA8080，日立高新技術(shù)公司）；臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ5-WS，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司）。

1.3 水解條件選擇

以酶解時(shí)間、酶解溫度和酶用量為單因素，以酸溶蛋白含量為指標(biāo)，篩選各酶的最佳水解條件。以游離氨基酸和小肽含量綜合考慮，選出水解效果最佳的酶。在單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3 因素3 水平正交實(shí)驗(yàn)來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.4 酶解魚(yú)溶漿的制備

取青占魚(yú)蛋白水500 g，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求分別調(diào)整酶解溫度、酶解時(shí)間、酶用量，水解結(jié)束后沸水浴滅酶20 min，85 ℃真空濃縮為40%含水量的酶解魚(yú)溶漿，常溫保存待測(cè)。

1.5 測(cè)定方法

水分測(cè)定：105 ℃干燥至恒重(GB/T 6435—2014)；粗蛋白質(zhì)測(cè)定：凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)；粗脂肪測(cè)定：索氏抽提法(GB/T 6433—2006)；灰分測(cè)定：干法灰化法(GB/T 6438—2007)。

酸溶蛋白、游離氨基酸、小肽含量的測(cè)定參考GB/T 22729—2008 中方法。低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)水解物（包括小肽和游離氨基酸）可溶于三氯乙酸溶液；高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)在三氯乙酸溶液中易沉淀。樣品經(jīng)三氯乙酸溶液溶解后，離心分離出沉淀蛋白質(zhì)，收集離心清液，測(cè)定離心清液的酸溶蛋白質(zhì)水解物含量，清液的酸溶蛋白質(zhì)水解物含量減去游離氨基酸含量得到小肽的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 青占魚(yú)蛋白水基本營(yíng)養(yǎng)成分（見(jiàn)表1）

表1 青占魚(yú)蛋白水基本營(yíng)養(yǎng)成分

從表1可以看出，青占魚(yú)蛋白水的粗蛋白質(zhì)含量為79.0 g/100 g（干物質(zhì)），有巨大開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。蛋白水脂肪含量?jī)H0.74 g/100 g（干物質(zhì)），長(zhǎng)期儲(chǔ)存不會(huì)出現(xiàn)油脂氧化現(xiàn)象。水分含量為90.67 g/100 g，不需調(diào)節(jié)底物濃度即可酶解。

2.2 熱處理對(duì)魚(yú)溶漿酶解效果的影響

蛋白水在適宜酶解溫度（復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶50 ℃，中性蛋白酶55 ℃）、pH 值（復(fù)合蛋白酶與堿性蛋白酶為自然pH 值8.3，中性蛋白酶pH 值7.0）條件下分別加入3 種酶，酶用量0.3%（干物質(zhì)），水解3 h。熱處理的蛋白水沸水浴20 min后降溫至適宜酶解溫度再進(jìn)行水解，根據(jù)酸溶蛋白生成量（干物質(zhì)）確定熱處理對(duì)酶解效果的影響。同時(shí)做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，不經(jīng)過(guò)酶解處理的對(duì)照組ASP含量為25.6 g/100 g，復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶水解的酶解魚(yú)溶漿，ASP 含量分別升高了1.8、1.6、1.7 倍。酶解前熱處理對(duì)3 種蛋白酶的水解效果影響不顯著（P＞0.05）。張其標(biāo)等[9]以中性蛋白酶和酸性蛋白酶水解鰱魚(yú)蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)經(jīng)加熱變性后能有效提高酶解效率，而本研究中酶解效率提高不顯著，可能是因?yàn)樵萧~(yú)在壓榨前已經(jīng)過(guò)加熱，榨汁中蛋白質(zhì)已經(jīng)變性，再次熱處理對(duì)酶解過(guò)程促進(jìn)作用不佳。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蛋白水不經(jīng)過(guò)熱處理。

2.3 蛋白水酶解單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 溫度對(duì)酸溶蛋白含量的影響

在酶用量0.3%，酶解時(shí)間3 h，酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃條件下進(jìn)行水解，根據(jù)酸溶蛋白含量確定適宜的酶解溫度。結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知，隨著酶解溫度的升高，酸溶蛋白含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶在50 ℃時(shí)達(dá)到最高，而中性蛋白酶在55 ℃最高。酶解溫度過(guò)低或過(guò)高時(shí)，蛋白酶的活性受到抑制。當(dāng)酶解溫度趨近酶解最適溫度時(shí)，酶解率最高，因此復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶的酶解溫度為50 ℃，中性蛋白酶為55 ℃。

圖1 熱處理對(duì)酶解魚(yú)溶漿酸溶蛋白含量（干物質(zhì)）的影響

圖2 溫度對(duì)酸溶蛋白含量的影響

2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)酸溶蛋白含量的影響

3 種蛋白酶分別在最適溫度，酶用量0.3%，酶解時(shí)間分別為1、2、3、4 h 的條件下進(jìn)行水解，根據(jù)酸溶蛋白含量確定適宜酶解時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酸溶蛋白含量也隨之增加。酸溶蛋白含量的增加速度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，堿性蛋白酶在2 h 以后變化較小，而復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶在3 h 后趨于平緩。因此，選擇適宜的酶解時(shí)間為3 h。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)酸溶蛋白含量的影響

2.3.3 酶用量對(duì)酸溶蛋白含量的影響

3 種蛋白酶在最適溫度，酶用量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%（干物質(zhì)）的條件下水解3 h，根據(jù)酸溶蛋白含量確定適宜酶用量。結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)酶用量增加時(shí)，底物水解反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，蛋白質(zhì)水解程度加大，酸溶蛋白含量升高，酶用量超過(guò)0.3%時(shí)，增加速度較小。當(dāng)酶底物濃度達(dá)到一定比值，再增加酶濃度難以促進(jìn)水解反應(yīng)。因此，適宜的酶用量為0.3%。

圖4 酶添加量對(duì)酸溶蛋白含量的影響

2.4 蛋白酶的選擇

在適宜的酶解溫度（復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶50 ℃，中性蛋白酶55 ℃），酶用量0.3%條件下以分別加入3 種酶，水解3 h，根據(jù)小肽、游離氨基酸含量選擇合適的酶。同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5 可知，與對(duì)照組相比，3 種蛋白酶處理的酶解魚(yú)溶漿游離氨基酸分別升高1.5、1.3、1.7 倍，小肽含量升高1.9、1.7、1.8 倍，變化顯著（P＜0.05）。低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)水解物主要包括小肽和游離氨基酸，在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中小肽比游離氨基酸表現(xiàn)出更高的生物學(xué)價(jià)值[8-10]，所以酶解魚(yú)溶漿的制備需要是控制游離氨基酸的產(chǎn)生，提高小肽含量。3 種蛋白酶水解的酶解魚(yú)溶漿游離氨基酸含量差異不顯著（P＞0.05），而復(fù)合蛋白酶水解后小肽含量最高，顯著高于堿性蛋白酶（P＜0.05）?？紤]中性蛋白酶需要調(diào)節(jié)pH 值，較高的酶解溫度在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中需要消耗更多能量。所以，復(fù)合蛋白酶為水解青占魚(yú)蛋白水最適蛋白酶。

2.5 蛋白水酶解工藝正交優(yōu)化

為了獲得具有較高酸溶蛋白含量的酶解魚(yú)溶漿，在單因素的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和酶用量對(duì)酶解魚(yú)溶漿酸溶蛋白含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)3 因素3 水平正交實(shí)驗(yàn)來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)因素的水平見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)3。

圖5 3種蛋白酶對(duì)魚(yú)溶漿游離氨基酸、小肽含量的影響

表2 正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表

由表3中極差R值大小顯示，各因素作用主次為溫度＞時(shí)間＞酶用量。對(duì)各因素進(jìn)行直觀分析，時(shí)間：K3＞K2＞K1；溫度：K2＞K3＞K1；酶用量：K3＞K2＞K1。充分考慮到實(shí)際生產(chǎn)節(jié)約成本，綜上所述酶解魚(yú)溶漿生產(chǎn)最佳配比組合確定為：A3B2C2，即50 ℃條件下，添加0.3%復(fù)合蛋白酶（干物質(zhì)），水解3 h。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.6 最佳酶解工藝的驗(yàn)證

稱取榨汁500 g，待升溫到50 ℃后，按干物質(zhì)含量加入復(fù)合蛋白酶0.3%，水解3 h進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。此條件下，酸溶蛋白含量為75.83 g/100 g，蛋白質(zhì)水解效率達(dá)95.29%(酸溶蛋白/粗蛋白質(zhì))。

3 結(jié)論

采用復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶水解青占魚(yú)蛋白水制備酶解魚(yú)溶漿，以酸溶蛋白含量為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)確定了蛋白水的較佳工藝條件。在適宜反應(yīng)條件下，根據(jù)蛋白質(zhì)水解物的小肽、游離氨基酸含量，確定復(fù)合蛋白酶為水解青占魚(yú)蛋白水最適蛋白酶。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，用正交法對(duì)復(fù)合蛋白酶的水解條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度50 ℃，酶用量0.3%（干物質(zhì)），水解3 h。該條件下制得的酶解魚(yú)溶漿酸溶蛋白含量為75.83 g/100 g（干物質(zhì)），蛋白質(zhì)水解效率達(dá)95.29%。