龔 頻， 劉 萌， 李曉凡， 文 和

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國大約有1.14億糖尿病患者，糖尿病發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到11.6%.2017年國務(wù)院辦公廳印發(fā)《中國防治慢性病中長期規(guī)劃(2017～2025年)》中指出糖尿病是我國慢性病中長期防治工作的重點(diǎn)領(lǐng)域.由于糖代謝障礙，2型糖尿病病人常常伴有微量元素鎂( Mg) 、鐵( Fe) 、鋅( Zn) 、銅( Cu) 、鈣( Ca) 的代謝紊亂，可能是由于這些元素在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著特定的作用[1-4]，這些必需元素的缺乏或過量可能造成病情的加重[5,6].

本實(shí)驗(yàn)以高脂高糖和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型為研究對(duì)象，對(duì)大鼠各組織及體液中的鋅、銅、鎂、鈣、鐵五種元素進(jìn)行含量測定，通過比較正常組及高脂高糖組大鼠各組織及體液中的元素含量，觀察其變化規(guī)律，闡明糖尿病必需元素變化的規(guī)律，從而為2型糖尿病的防治提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)SD大鼠30只，雄性(♂) ，體重約190～220 g，于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買.

生理鹽水，購于西安雙鶴制藥有限公司；磷酸氫二鈉、ZnSO4·7H2O、磷酸二氫鈉,購于成都金山化工試劑廠；濃硝酸、CH3COONa,購于天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；硫酸鐵銨、MgSO4·7H2O,購于天津市天力化學(xué)試劑有限公司；CuSO4·5H2O，購于天津市巴斯夫化工有限公司；CaSO4·2H2O，購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TDL-40B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型精密PH計(jì)，上海雷磁儀器公司；Z-2000型塞曼偏振光原子吸收光譜儀，日本HITACHI公司；SX-4-10型馬弗爐，北京科偉永興儀器公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立

30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周，自由進(jìn)水進(jìn)食，兩周后將大鼠完全隨機(jī)分為3組，每組10只(K、G、S).K組為空白組，普通飼料喂養(yǎng)；G組為高脂高糖組，高脂高糖飼料喂養(yǎng)；S組為損傷組，高脂高糖飼料喂養(yǎng).高脂高糖飼料成分配比如表1所示.

表1 高脂高糖飼料成分配比(%)

六周后，S組大鼠一次性腹腔內(nèi)注射STZ 30 mg/kg(溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液pH 4.4)，K、G組大鼠注射檸檬酸緩沖液pH 4.4.兩天后，每日清晨對(duì)大鼠稱重，觀察大鼠生長情況，并進(jìn)行血糖樣本采集.

一般在禁食12小時(shí)后，尾靜脈取血，采用羅氏血糖儀測其空腹血糖值(FBG )，驗(yàn)證模型搭建是否成功.

1.3 檢測方法

1.3.1 組織中的元素含量檢測

采用火焰法原子吸收光譜儀檢測大鼠組織中各元素含量.

(1)組織中Zn2+含量檢測

①鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取 ZnSO4·7H2O，用雙蒸水溶解成含 Zn2+為1 mg/L 的儲(chǔ)備液，使用前逐級(jí)稀釋為0.8、0.6、0.4、0.2 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)液，于-4 ℃冷凍保存.測量時(shí)，按照Zn2+濃度從小到大的梯度依次進(jìn)樣，測定不同濃度下 Zn2+溶液的吸光值，繪制鋅溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線.

②待測樣品制備

準(zhǔn)確稱取一組，3份新鮮組織(包括空白組、高脂高糖組、損傷組)，置于坩堝內(nèi)，按順序置于馬弗爐中，500 ℃灰化6 h后，自然冷卻，用10 mL混酸分三次溶解樣品殘?jiān)^濾，最后將樣品組織的混酸溶液轉(zhuǎn)移集中，于-4 ℃冷凍保存.

③樣品鋅元素的測定按照硫酸鋅標(biāo)準(zhǔn)液中Zn2+濃度從小到大的順序依次進(jìn)樣，取得標(biāo)準(zhǔn)曲線.當(dāng)R2>0.99時(shí)，開始進(jìn)行樣品測量.記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，繪制大鼠各組織Zn2+含量圖.

(2)組織中其余元素含量檢測

均與鋅元素相同.

1.3.2 血清中的元素含量檢測

采用火焰法原子吸收光譜儀進(jìn)行檢測.采用65% HNO3和30% H2O2作為消解試劑，前處理方法為0.25 mL血清，加入0.8 mL 65% HNO3和0.2 mL 30% H2O2，水浴鍋中90 ℃加熱消解3 h后，用雙蒸水稀釋至10 mL，于-4 ℃冰箱冷凍保存待測.測量時(shí)依舊先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)R2>0.99時(shí)，開始進(jìn)行樣品測量.記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值.

1.3.3 尿液中的元素含量檢測

建立尿液中元素直接稀釋的火焰法原子吸收光譜進(jìn)行分析.將待測量尿樣進(jìn)行多次過濾，每個(gè)尿樣取量2 mL于10 mL的離心管稀釋至最高刻度，于-4 ℃冰箱冷凍保存待測.

測量時(shí)依舊先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)R2>0.99時(shí)，開始進(jìn)行樣品測量.記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值[7].

2 結(jié)果與討論

2.1 Zn元素各組織及體液中的含量變化

如圖1 所示，高脂高糖組大鼠及損傷組大鼠肝、腎、心、胰組織及血液中Zn2+的含量較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05,p<0.01).高脂高糖組與損傷組大鼠尿液中Zn2+的含量較正常組顯著升高(p<0.01).

(a)Zn元素在各組織中的含量

(b)Zn元素在各體液中的含量圖1 Zn元素在不同組別各組織及體液中的含量

Zn2+與糖尿病的聯(lián)系十分緊密，其直接參與人體內(nèi)胰島素的生成、分泌、儲(chǔ)備、降解以及機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性.Zn2+分布在β細(xì)胞顆粒中，能促進(jìn)胰島素的結(jié)晶化，提高胰島素的穩(wěn)定性，并可調(diào)節(jié)胰島素的降糖作用，Zn2+同時(shí)也是糖代謝關(guān)鍵酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等的輔酶因子[8,9].葡萄糖誘導(dǎo)Zn2+細(xì)胞色素增加，這可能有利于胰島素的加工和儲(chǔ)存及其與Zn2+的共結(jié)晶，持續(xù)高血糖后Zn2+細(xì)胞因子的慢性增加可能導(dǎo)致某些形式的糖尿病中的β細(xì)胞功能障礙和死亡.

因而2型糖尿病大鼠肝、腎、心、胰組織及血液中的鋅含量減少可能與胰島細(xì)胞受損及數(shù)量減少相關(guān)，同時(shí)，尿液中的Zn2+含量上升，表明體內(nèi)流失的Zn2+主要通過尿液排泄，高脂高糖模型組Zn2+含量的變化介于正常組和損傷組之間，表明高脂高糖同樣也能夠引起體內(nèi)Zn元素的紊亂，最終誘導(dǎo)2型糖尿病的發(fā)生.

2.2 Cu元素在各組織及體液中的變化

如圖2所示，高脂高糖組大鼠及損傷組大鼠肝、腎、心、胰組織及血、尿液中Cu2+的含量較空白組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05,p<0.01,p<0.001).

銅是參與人體多種酶活性及代謝水平的微量元素，銅被吸收轉(zhuǎn)運(yùn)后，主要以結(jié)合銅藍(lán)蛋白形成存在,可影響體內(nèi)代謝水平.

本研究中糖尿病大鼠血清中銅元素明顯高于正常組，與血漿銅藍(lán)蛋白減少及其結(jié)合活性降低有關(guān)，從而導(dǎo)致血漿中游離的銅增加.銅引起糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能是由于鋅和銅在腸道吸收過程中競爭同一載體蛋白-金屬硫蛋白.銅增多時(shí)則會(huì)影響鋅的吸收，使得體內(nèi)鋅大量丟失，而鋅的減少會(huì)促使糖尿病的發(fā)生[10].通常糖尿病患者體內(nèi)銅含量增高，銅、鋅比值增大，機(jī)體出現(xiàn)高銅低鋅的狀態(tài)，銅的體內(nèi)平衡代謝異常會(huì)加劇鋅元素的平衡的改變.Kiza T G等[11]觀察到銅在糖尿病患者血清中含量較高.這也與本研究結(jié)果一致.

(a)Cu元素在各組織中的含量

(b)Cu元素在各體液中的含量圖2 Cu元素在不同組別各組織及體液中的含量

2.3 Mg元素在各組織及體液中的變化

如圖3所示，高脂高糖組大鼠及損傷組大鼠肝、腎、心、胰組織及血液中Mg2+的含量較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05，p<0.01，p<0.001).高脂高糖組與損傷組大鼠尿液中Mg2+的含量較正常組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01，p<0.001).

(a)Mg元素在各組織中的含量

(b)Mg元素在各體液中的含量圖3 Mg元素在不同組別各組織及體液中的含量

鎂離子是Na+-K+-ATP酶的重要激活劑，與ATP能否發(fā)揮正常作用相關(guān)，因此鎂離子會(huì)影響糖代謝過程中許多限速酶和其他重要酶類的生理活性.其含量的變化會(huì)直接影響到肝糖原的合成，導(dǎo)致糖異生酶的活性增強(qiáng)，胰島素對(duì)葡萄糖的反應(yīng)受到抑制，同時(shí)低鎂的狀態(tài)還會(huì)使胰島α細(xì)胞釋放更多的胰高血糖素，因此，糖尿病組大鼠組織與血清中鎂元素含量減少.

糖尿病患者肝、腎、心、胰組織及血清鎂降低的機(jī)理可能為：(1)高血糖的滲透性利尿作用，造成鎂持續(xù)性地從尿中大量丟失；(2)大量的葡萄糖濾入原尿與鎂互相競爭，從而抑制了腎小管對(duì)鎂的重吸收；(3)糖尿病患者腎小管分泌鎂增多以及鎂被轉(zhuǎn)移到骨和細(xì)胞中；(4)外源性胰島素的應(yīng)用可使尿鎂排泄增多及肌肉攝取鎂增加；(5)維生素D的代謝障礙影響腸道對(duì)鎂吸收.

2.4 Ca元素在各組織及體液中的變化

如圖4所示，高脂高糖組大鼠及損傷組大鼠肝、腎、心、胰組織及血液中Ca2+的含量較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05,p<0.01,p<0.001).高脂高糖組與損傷組大鼠尿液中Ca2+的含量較正常組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01，p<0.001).

(a)Ca元素在各組織中的含量

(b)Ca元素在各體液中的含量圖4 Ca元素在不同組別各組織及體液中的含量

胰島素分泌是由胰島β細(xì)胞內(nèi)鈣離子的迅速升高直接觸發(fā)的，鈣代謝紊亂在糖尿病患者發(fā)病過程中也非常明顯[12].糖尿病大鼠胰島素降糖功能下降，所以鈣元素在組織與血液中的含量減少，但實(shí)驗(yàn)中大鼠血液中鈣含量未出現(xiàn)明顯下降，其原因與骨鈣動(dòng)員結(jié)果相關(guān).如果血糖病情長期控制欠佳，即會(huì)導(dǎo)致鈣流失，最終則引起骨質(zhì)疏松.

2.5 Fe元素在各組織及體液中的變化

如圖5所示，高脂高糖組大鼠及損傷組大鼠肝、腎、心、胰組織及血液中Fe2+的含量較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05,p<0.01,p<0.001),而尿液中鐵元素含量極低，無法得到有效數(shù)據(jù)，推測鐵元素經(jīng)由尿液排泄量極少，沒有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù).

(a)Fe元素在各組織中的含量

鐵元素在氧氣運(yùn)輸和儲(chǔ)存方面有著重要作用，體內(nèi)鐵元素缺乏所導(dǎo)致的氧氣含量降低，使得有氧氧化進(jìn)程受阻，影響TCA循環(huán)，糖異生及其他營養(yǎng)物質(zhì)的代謝[13,14]；同時(shí)氧氣含量低使胰島素分泌合成受阻，影響血糖穩(wěn)定.

3 結(jié)論

糖尿病是一種內(nèi)分泌紊亂引起的疾病，其發(fā)病機(jī)理尚不明確，已有研究表明微量元素與糖尿病發(fā)生存在一定關(guān)系.本實(shí)驗(yàn)通過以高脂高糖飲食加鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型為研究對(duì)象，分析2型糖尿病大鼠模型肝、腎、心、胰組織及血、尿液中的必需元素含量，探討其變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠肝、腎、心、胰組織及血清中Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+的含量顯著減少，Cu2+的含量顯著增加.同樣也發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠尿液中Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+的含量顯著增加.因此高脂高糖聯(lián)合STZ能夠加速體內(nèi)五種元素的紊亂，促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生.

研究表明體內(nèi)銅增多導(dǎo)致大量鋅元素丟失，鋅元素不僅可以調(diào)節(jié)胰島素的降糖作用，同時(shí)也可提高胰島素的穩(wěn)定性，鋅的含量可直接影響胰島素的合成與活性.當(dāng)體內(nèi)缺鋅時(shí)，胰島素原有的轉(zhuǎn)化率降低，使體液中胰島素水平降低，血糖濃度升高，兩種元素的紊亂更進(jìn)一步加重糖尿病的病情；鈣通量的改變可能會(huì)影響β細(xì)胞分泌功能，使胰島素釋放異常，胞漿鈣穩(wěn)態(tài)變化將導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生；鎂含量低會(huì)影響胰島α細(xì)胞釋放增高胰高血糖素，從而導(dǎo)致血糖升高；鐵元素的缺乏會(huì)產(chǎn)生過多自由基，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，促進(jìn)糖尿病的發(fā)生.

綜上所述，糖尿病患者的必需元素代謝紊亂與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展存在著一定的關(guān)系[15]，必需微量元素水平的慢性改變可能促進(jìn)與長期糖尿病相關(guān)的繼發(fā)并發(fā)癥的發(fā)展.因此調(diào)節(jié)必需微量元素，有助于對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療.