葉偉瓊，陳 潔，黃云玲，牛 婕，祝鵬輝，吳麗麗，嚴(yán) 燦

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究中心，廣東 廣州 510006)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是個體經(jīng)歷了威脅生命的重大創(chuàng)傷事件之后，延遲出現(xiàn)的身心疾病。其核心癥狀包括創(chuàng)傷經(jīng)歷的病理性重現(xiàn)、警覺性增高和持續(xù)性回避，此外，還會有恐懼、焦慮和抑郁等常見臨床表現(xiàn)。PTSD在當(dāng)今社會中發(fā)病率不斷提高，并且難以治愈，終身患病率高[1]，引起了社會各界的關(guān)注。目前，治療PTSD的臨床一線藥物都是以抗抑郁藥為主，包括5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)和選擇性5-羥色胺與去甲腎上腺素再攝取抑制劑(serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors，SNRIs)，如帕羅西汀(paroxetine，PRX)、文拉法辛等。但是這些抗抑郁的藥物并不能完全治愈PTSD，有些癥狀仍長期存在。此外，長期服用此類藥物還會出現(xiàn)明顯的副作用。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)安全有效的抗PTSD新藥非常必要。

單一延長應(yīng)激(single prolonged stress，SPS)是目前研究PTSD最常采用的動物造模方法之一，SPS很好地模擬了PTSD患者的臨床表現(xiàn)，如焦慮抑郁、易激惹、高喚醒、學(xué)習(xí)記憶能力下降等[2]。皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)是評價下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸功能的一個重要指標(biāo)。但是，對PTSD而言，不管是臨床還是對嚙齒類動物的研究，有關(guān)外周血中CORT水平的報道卻不盡相同，或升高或下降或不變[3]。由于PTSD是遲發(fā)性的精神心理疾病，因此，不同時間點的檢測可能會對CORT的結(jié)果造成重要影響。盡管有關(guān)CORT的報道不一致，但HPA軸負(fù)反饋增強(qiáng)是有關(guān)PTSD的較為公認(rèn)的病理基礎(chǔ)[4]，因此，調(diào)節(jié)HPA軸功能紊亂對于PTSD治療具有重要的意義。龜鹿二仙膠(Guiluerxianjiao，GLEXJ)由鹿角膠、龜板、枸杞子、人參組成，具有補(bǔ)腎填精的功效。研究發(fā)現(xiàn)，GLEXJ能提高自然衰老小鼠的抗氧化能力和學(xué)習(xí)記憶能力，明顯改善一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病患者的癥狀體征，顯示出其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的良好效果[5]。本研究采用SPS方法建立PTSD大鼠模型，在不同時間點動態(tài)觀察PTSD大鼠HPA軸功能和行為學(xué)的變化，以及GLEXJ的影響，以期揭示GLEXJ治療PTSD的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及飼養(yǎng)環(huán)境SPF級成年SD大鼠282只，體質(zhì)量(180～220) g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)-2016-0041。大鼠每籠5只，隨機(jī)分成正常組(control)、模型組(SPS)、龜鹿二仙膠組(GLEXJ)和帕羅西汀組(PRX)。整個實驗過程中大鼠自由飲食，飼養(yǎng)在室溫(23±2)℃，濕度(55±5)%，12 h光照/黑暗周期的環(huán)境中。所有的動物實驗均符合廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會的要求。

1.2 藥物的制備與給藥方法鹿角膠、龜板、枸杞子、黨參，均購于廣州至信藥業(yè)股份有限公司，按3 ∶2 ∶2 ∶1的比例，水煎濃縮至所需濃度，給藥劑量為3.6 g·kg-1。PRX購于浙江華海藥業(yè)股份有限公司(規(guī)格：每片20 mg，批號：H20031106)，用蒸餾水配制成2 g·L-1的溶液待用，給藥劑量為10 mg·kg-1。自造模后d 8起，每日8 ∶30～10 ∶30對GLEXJ和PRX組大鼠分別灌胃給藥，連續(xù)14 d或21 d；對正常組和模型組大鼠則給予純水灌服。地塞米松磷酸鈉注射液，購于遂成藥業(yè)股份有限公司(規(guī)格：5 mg·mL-1，批號：H41021255)。體積分?jǐn)?shù)為0.05的葡萄糖注射液，購于廣東科倫藥業(yè)有限公司(規(guī)格：50 mg·mL-1，批號：H51020636)。地塞米松磷酸鈉注射液用體積分?jǐn)?shù)為0.05葡萄糖注射液配制成濃度為1.5 g·L-1的溶液待用。

1.3 試劑與儀器CORT ELISA試劑盒(批號：ab108821)，購于英國Abcam公司；促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH) ELISA試劑盒(批號：ESB-EO6875r)，購于武漢華美生物工程有限公司；水合氯醛(批號：Q/12DJ0149-2014)，購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙醚(批號：20180102-1)，購于廣州化學(xué)試劑廠。YZB/USA3903-2010多功能酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)；GB/T23111電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；YHC-11001A體重秤(瑞安市英衡電器有限公司)；曠場實驗設(shè)備(TM-ZFT)、高架十字迷宮實驗設(shè)備(TM-GJT)及視頻分析系統(tǒng)，均由廣州飛迪生物科技公司提供。

1.4 PTSD大鼠模型的制備采用目前公認(rèn)，也是文獻(xiàn)報道最多的SPS方法制備PTSD大鼠模型[4]。SPS造模方法：經(jīng)過7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，除正常組外，所有的大鼠均先束縛2 h，再強(qiáng)迫游泳20 min，休息15 min，最后乙醚麻醉至意識喪失后，放回原籠繼續(xù)無打擾靜養(yǎng)7 d。束縛器為直徑6 cm、深20 cm的可活動亞克力裝置。游泳裝置為直徑20 cm、高50 cm的亞克力游泳桶，游泳時水深35 cm，水溫(24±1)℃。

1.5 體質(zhì)量測量分別稱量大鼠造模后第1周、第3周、第5周，即造模后d 8、22、28的體質(zhì)量。

1.6 行為學(xué)檢測造模后d 8、9、22、23、29、30，進(jìn)行曠場實驗(open field test，OFT)和高架十字迷宮實驗(elevated plus maze test，EPMT)，檢測大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。所有行為學(xué)檢測均在17 ∶00～23 ∶00進(jìn)行，OFT后24 h，再進(jìn)行EPMT實驗。

1.6.1OFT實驗 OFT是檢測大鼠焦慮樣行為和自主活動的經(jīng)典實驗[2]。曠場裝置由100 cm×100 cm×40 cm的黑色亞克力敞口曠場箱、紅外攝像頭及分析軟件組成。在黑暗的條件下，將大鼠放置于曠場箱中央，攝像頭記錄大鼠5 min的活動，由分析軟件計算出總路程，即代表大鼠的自主活動。每次實驗間隙予體積分?jǐn)?shù)為0.01的苯扎溴銨溶液擦洗曠場箱后，用體積分?jǐn)?shù)為0.75的酒精擦干，以減少動物間的干擾。

1.6.2EPMT實驗 EPMT用于檢測大鼠的焦慮樣行為。大鼠探索開放臂活動減少，代表其有較高的焦慮情緒[6]。高架十字迷宮的裝置由距離地面高36 cm的2條相對開放臂(15 cm×48 cm)和2條相對閉合臂(15 cm×48 cm×40 cm)及中央?yún)^(qū)(15 cm×15 cm)連接而成。設(shè)備上方安裝跟蹤攝像頭，由分析軟件計算出5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比、開放臂路程百分比及開放臂時間百分比。每次實驗前均用體積分?jǐn)?shù)為0.01的苯扎溴銨溶液清洗大鼠活動區(qū)，再用體積分?jǐn)?shù)為0.75的酒精擦干，后將大鼠頭朝固定開放臂放入中央?yún)^(qū)。

1.7 地塞米松抑制實驗(dexamethasone suppression test，DST)DST是利用SPS-再應(yīng)激(束縛制動)的模式，檢測血漿ACTH含量，用以反映HPA軸快速負(fù)反饋功能[4]。DST分別在造模后d 8和d 22進(jìn)行。首先，向大鼠皮下注射地塞米松(3 mg·kg-1)，再立即束縛30 min，解除束縛后，用體積分?jǐn)?shù)為0.07的水合氯醛麻醉，而后眼眶靜脈取血。血液用含EDTA的采血管采集，3 000 r·min-1、4 ℃離心10 min后，吸取上清到另一1 mL的EP管，存放于-80 ℃冰箱中。ACTH檢測采用ELISA法，操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 CORT檢測CORT檢測分別于造模后d 8、22、28進(jìn)行，乙醚輕度麻醉大鼠后，眼眶靜脈取血，血漿收集及保存方法如上所述。血漿中CORT水平用ELISA法檢測，按照說明書方法操作。每個實驗流程如Fig 1所示，為防止3個實驗間相互影響及重復(fù)檢測帶來的干擾，不同實驗及不同觀察時間點均選用不同批次的大鼠獨立進(jìn)行。

Fig 1 Experimental design

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量結(jié)果各組大鼠體質(zhì)量變化如Fig 2所示，各組間體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)。

Fig 2 Effect of GLEXJ on body mass of PTSD model rats after

Week1,n=31;Week4,n=30～32;Week 5,n=23～24

2.2 OFT結(jié)果如Fig 3所示，與正常組相比，模型組的總路程在SPS后d 8、22均有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；d 29總路程明顯下降(P<0.01)。GLEXJ和PRX連續(xù)給藥14 d，即SPS后d 22，總路程有升高的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；連續(xù)給藥21 d，即SPS后d 29，總路程均明顯增加(P<0.01)。

Fig 3 Effects of GLEXJ on locomotor

The behavior was presented by total distances in the OFT(1.Control; 2. SPS; 3. PRX; 4. GLEXJ).#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsSPS.

2.3 EPMT結(jié)果如Fig 4所示，與正常組相比，SPS后d 9模型組的開放臂時間百分比、開放臂路程百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比則明顯下降(P<0.05)。SPS后d 23、30，模型組的開放臂時間百分比與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是開放臂路程百分比和進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。GLEXJ組與PRX組連續(xù)給藥14 d后，大鼠開放臂時間百分比、開放臂路程百分比、進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比有升高的趨勢，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。GLRXJ組連續(xù)給藥21 d后，大鼠開放臂時間百分比、開放臂路程百分比有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而進(jìn)入開放臂次數(shù)比明顯升高(P<0.01)。PRX組連續(xù)給藥21 d后，大鼠開放臂時間百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，開放臂路程百分比和進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

2.4 DST結(jié)果如Fig 5所示，SPS后d 8，與正常組相比，模型組的血漿ACTH含量明顯下降(P<0.05)。到d 22時，血漿ACTH仍明顯低于對照組(P<0.01)。GLEXJ組和PRX組連續(xù)給藥14 d后，兩組大鼠血漿ACTH含量均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

2.5 CORT檢測結(jié)果如Fig 6所示，SPS后d 8模型組CORT水平與正常組相比，差異無統(tǒng)計意義；d 22模型組CORT水平雖有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；d 29，模型組CORT水平明顯升高(P<0.01)。GLEXJ連續(xù)給藥14 d后，大鼠CORT水平略有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在連續(xù)給藥21 d后，大鼠CORT水平與模型組比較明顯下降(P<0.05)。PRX連續(xù)給藥14 d后，大鼠CORT水平與模型組比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；連續(xù)給藥21 d后，CORT水平明顯下降(P<0.01)。

The behavior was presented by the percentages of time (A), distance; (B), entries; (C) into the open arms: 1.Control; 2. SPS; 3. PRX; 4. GLEXJ.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsSPS.

3 討論

在PTSD的研究中，其HPA軸功能的改變一直是人們關(guān)注的重點。CORT是HPA軸分泌的終末激素，通常用來評價HPA軸的基礎(chǔ)功能。由于PTSD患者HPA軸功能紊亂，機(jī)體對這種紊亂的自我調(diào)節(jié)與適應(yīng)是一個長期的過程，在此過程中，HPA軸的基礎(chǔ)功能和負(fù)反饋功能相互影響，使得皮質(zhì)醇呈現(xiàn)出長期的動態(tài)變化。所以在不同時間點檢測外周血皮質(zhì)醇水平，結(jié)果會不盡相同，或升高或降低或不變[3]。嚙齒動物研究中，CORT的報道也是如此[7-8]。雖然皮質(zhì)醇含量變化的報道不一致，但是PTSD患者普遍存在著HPA軸負(fù)反饋增強(qiáng)的現(xiàn)象[9]。Liberzon等[4]利用SPS-再應(yīng)激(束縛制動)的研究模式，通過對比造模前后注射皮質(zhì)醇與不注射皮質(zhì)醇的大鼠，在束縛30 min后血漿ACTH的含量，發(fā)現(xiàn)如果大鼠的HPA軸負(fù)反饋增強(qiáng)，則ACTH的含量會明顯下降。我們采用相同的方法研究發(fā)現(xiàn)，在SPS后的d 8，模型組大鼠的HPA軸負(fù)反饋功能出現(xiàn)增強(qiáng)，而且這種改變到d 22時仍然存在。在本研究中，在不實施再應(yīng)激的情況下，我們從造模后d 8～29，動態(tài)觀察了各組大鼠血漿CORT水平的變化。結(jié)果表明，模型組大鼠d 8雖然出現(xiàn)HPA軸負(fù)反饋功能增強(qiáng)，但外周血CORT水平并沒有發(fā)生改變；d 22時雖然大鼠HPA軸負(fù)反饋功能增強(qiáng)仍然存在，但血漿CORT水平卻呈現(xiàn)出升高的趨勢；到d 29血漿CORT水平則明顯升高。雖然血漿CORT水平的檢測結(jié)果與一些文獻(xiàn)報道一致[2]，但為什么在HPA軸負(fù)反饋增強(qiáng)的情況下，會出現(xiàn)血漿CORT水平不降反升的現(xiàn)象？有研究認(rèn)為，負(fù)反饋增強(qiáng)是HPA軸整體功能紊亂過程中的一種表現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體對這種功能亢進(jìn)逐漸適應(yīng)時，CORT對ACTH的刺激敏感性下降，進(jìn)而開始分泌減少[10]。此外，有學(xué)者提出，PTSD患者皮質(zhì)醇的分泌具有時間序列特征，表現(xiàn)為先升高，然后持續(xù)高水平，再降低，最后持續(xù)在低水平階段[3]。在本研究中，d 29的模型大鼠可能仍處于PTSD發(fā)病的早期階段，故CORT水平表現(xiàn)出升高的狀態(tài)。隨著機(jī)體對HPA軸功能亢進(jìn)的逐漸適應(yīng)，CORT水平可能會出現(xiàn)下降。此外還有一些研究發(fā)現(xiàn)，PTSD患者皮質(zhì)醇水平出現(xiàn)不一致的情況除了與檢測時間不同有關(guān)外，還可能跟性別有關(guān)，皮質(zhì)醇水平下降的結(jié)果通常出現(xiàn)在有關(guān)女性PTSD群體的研究中[11]，而在有關(guān)男性PTSD群體的研究中，皮質(zhì)醇常出現(xiàn)升高或不變[12]。本實驗觀察到的CORT升高現(xiàn)象也可能與我們選用的動物性別有關(guān)，考慮到♀動物自身的性激素周期性變化可能會影響研究結(jié)果[13]，故均選用了♂大鼠。本研究發(fā)現(xiàn)，GLEXJ在連續(xù)給藥14 d后，能明顯抑制HPA軸負(fù)反饋功能的增強(qiáng)，血漿CORT水平呈現(xiàn)下降趨勢；在連續(xù)給藥21 d后，大鼠血漿CORT水平明顯下降。實驗結(jié)果表明，GLEXJ能調(diào)節(jié)SPS導(dǎo)致的HPA軸功能紊亂。

Fig 5 Effects of GLEXJ on content

1.Control; 2. SPS; 3. PRX; 4. GLEXJ.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsSPS

Fig 6 Effects of GLEXJ on levels

1.Control; 2. SPS; 3. PRX; 4. GLEXJ.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsSPS

OFT是利用大鼠對新環(huán)境的探索行為和趨避性，來檢測大鼠自發(fā)活動的良好方法，用總路程來評價大鼠的自發(fā)活動情況。EPMT則是檢測大鼠焦慮水平的常見方法。EPMT主要測試動物的非條件性反射，利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼心理所形成的矛盾沖突，來考察動物的焦慮狀態(tài)。進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比、開放臂停留時間百分比和開放臂路程百分比越低，代表焦慮水平越高[6]。OFT結(jié)果表明，在SPS造模后d 8、22，自主活動均沒有明顯改變，與很多文獻(xiàn)報道一致[2]，但在d 29時自主活動下降。EPMT結(jié)果表明，模型組大鼠從造模后d 9開始出現(xiàn)焦慮水平升高，持續(xù)到d 30，表現(xiàn)出持久的焦慮，這與其他文獻(xiàn)報道一致[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，GLEXJ在連續(xù)給藥14 d后能明顯改善SPS引起的大鼠焦慮樣行為，在連續(xù)給藥21 d后能明顯提高大鼠的自主活動能力。研究結(jié)果表明，GLEXJ能明顯改善SPS導(dǎo)致的行為學(xué)異常。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，HPA軸功能的紊亂是導(dǎo)致焦慮抑郁樣行為出現(xiàn)的重要機(jī)制。一般情況下，當(dāng)機(jī)體面對應(yīng)激，首先是交感神經(jīng)系統(tǒng)做出快速反應(yīng)，然后HPA軸功能激活，調(diào)節(jié)較長時間的應(yīng)激反應(yīng)，故HPA軸功能紊亂時會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)行為障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SPS大鼠HPA軸出現(xiàn)負(fù)反饋增強(qiáng)時，盡管當(dāng)時CORT水平?jīng)]有變化，但焦慮水平明顯升高，這與文獻(xiàn)報道一致[8]。HPA軸的負(fù)反饋功能主要受前額葉皮質(zhì)-海馬-杏仁核等腦區(qū)的糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)/鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子1型受體(corticotropin-releasing factor-1 receptor，CRF1R)表達(dá)的影響。近年來研究表明，這些腦區(qū)中MR和GR的表達(dá)對焦慮、恐懼情緒反應(yīng)等起重要調(diào)節(jié)作用[14]，杏仁核中CRF1R的表達(dá)增多，能導(dǎo)致焦慮樣行為的出現(xiàn)[15]。本研究結(jié)果表明，GLEXJ抑制了PTSD模型大鼠HPA軸負(fù)反饋功能的增強(qiáng)，改善了PTSD大鼠的行為異常，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HPA軸功能紊亂有關(guān)。但GLEXJ是如何影響HPA軸的高位調(diào)節(jié)中樞，以及與HPA軸負(fù)反饋密切相關(guān)的激素及其受體的關(guān)系尚不清楚。這將是我們今后進(jìn)一步深入研究的內(nèi)容。