王 珣，柯 旋，張遠恒，張 馳，孫斯琴

武漢市第三醫(yī)院(武漢大學附屬同仁醫(yī)院)1. 心內(nèi)科、2. 放射科，湖北 武漢 430061；3. 武漢市普仁醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430080

流行病學調(diào)查表明，糖尿病患者心血管疾病患病率是非糖尿病人群心血管疾病的2～3倍[1]，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者嚴重的心血管并發(fā)癥之一，研究DCM發(fā)病機制對尋找防治DCM的方法具有重要意義。近年來研究表明，自噬現(xiàn)象和DCM關(guān)系密切。在糖尿病轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，自噬是上調(diào)的，過表達Beclin-1促進過度自噬，導致了心肌肥厚加重，提示過度自噬導致了DCM。我們前期研究建立的DCM大鼠模型中心肌自噬是降低的，而且心肌纖維化明顯[2]。

所謂自噬，就是通過激活自噬相關(guān)蛋白誘導自噬發(fā)生，降解細胞內(nèi)長壽命蛋白、損傷蛋白及細胞器，并對降解后成分再利用[3]。生理條件下的自噬作為細胞應(yīng)激的保護機制，處于一種持續(xù)的低水平狀態(tài)，然而，環(huán)境非理性的變化會導致自噬過度激活，引起細胞程序性死亡。對于心肌細胞而言，適度的自噬對其功能維持起著重要作用，但也可能會引起心肌疾病[4]。

乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)最先發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)細胞合成的神經(jīng)遞質(zhì)，后來人們逐漸認識到，ACh在非神經(jīng)組織如上皮、內(nèi)皮、間皮等細胞中廣泛存在。通過自分泌或旁分泌作用，ACh可參與自身和臨近細胞基本功能的調(diào)節(jié)，如增殖、分化、凋亡、分泌、黏附、免疫功能等。心肌細胞可合成、釋放ACh，同樣，心肌細胞也分布著各種ACh受體(M、N受體)。研究表明，ACh激活M受體促進心肌細胞自噬，可減少缺氧/復(fù)氧過程中心肌凋亡[5]。但對于神經(jīng)遞質(zhì)在DCM中的作用不甚明確，既然自噬在DCM中有重要意義，而且ACh可調(diào)節(jié)心肌細胞自噬活性，那么ACh是否在DCM發(fā)生、發(fā)展中有一定的作用？本研究建立高糖誘導心肌細胞損傷模型，探討ACh能否改善高糖導致的心肌細胞損傷，并探究自噬在其中的作用及其機制，為治療DCM提供新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 大鼠心肌細胞系H9c2細胞，購自中國科學院細胞庫。

1.1.2試劑 ACh、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、雷帕霉素(rapamycin，Rap)、AICAR(AMPK激活劑)，購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清，購自ScienCell公司；β-actin抗體、二抗，購自中杉金橋公司；LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax、p62抗體，購自Cell Signaling Technology公司；AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、p-AMPK、p-mTOR、mTOR抗體，購自Abcam公司；MTT、ATP、BCA試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3儀器 生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)；倒置生物顯微鏡(日本Olympus公司)；全波段酶標儀(美國Thermo公司)；全套蛋白電泳電轉(zhuǎn)裝置(美國Bio-Rad公司)；超薄切片儀(德國Leica公司)；透射電鏡(日本JEOL公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組將H9c2心肌細胞復(fù)蘇后，在含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基2～3 d更換1次，待細胞貼壁生長至70%～80%時，消化收集細胞進行傳代，實驗所用細胞為7～15代細胞。實驗分為6組：(1)對照組(control)：用正常濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細胞72 h；(2)高糖(high glucose，HG)組：用含終濃度為30、17 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基[6]培養(yǎng)H9c2細胞72 h；(3)不同濃度ACh組：在含有30 mmol·L-1葡萄糖的心肌細胞培養(yǎng)基中，同時分別加入10-6、10-5、10-4nmol·L-1的ACh培養(yǎng)H9c2細胞72 h；(4)HG+3-MA組：在終濃度為30 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基中，同時加入2 mmol·L-1的3-MA，培養(yǎng)H9c2細胞72 h;(5)HG+ACh+Rap組：在終濃度為30 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基中，同時加入50 nmol·L-1的Rap及10-4nmol·L-1的ACh，培養(yǎng)H9c2細胞72 h;(6)HG+ACh+AICAR組：在終濃度為30 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基中同時加入10-4nmol·L-1的ACh及0.5 mmol·L-1AICAR[7]，培養(yǎng)H9c2細胞72 h。3-MA及Rap濃度借鑒于我們前期的實驗研究[8]。

1.3 MTT法檢測細胞活性取生長對數(shù)期細胞鋪板，每孔約104個細胞，每個藥物濃度設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置調(diào)零孔和對照孔，藥物處理結(jié)束后，加入10 μL MTT溶液，4 h后，加入150 μL二甲基亞砜充分溶解結(jié)晶，利用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測量吸光度值(OD)。細胞相對活性=(藥物組OD平均值-空白組OD值平均值)/(對照組OD值平均值-空白組OD值平均值)。

1.4 ATP含量的檢測按BCA蛋白提取試劑盒提取總蛋白，計算蛋白濃度，利用ATP試劑盒提供的ATP標準品制作出標準曲線，將待測樣品稀釋成不同濃度梯度，向96孔板中加入待測樣品，混勻后，用化學發(fā)光儀測定相對光單位(relative light unit, RLU)值，最后根據(jù)標準曲線計算出待測樣品中ATP的濃度，根據(jù)蛋白濃度，將ATP的濃度換算成μmol·g-1蛋白的形式。

1.5 Western blot檢測取出藥物處理后的H9c2細胞，在冷的RIPA蛋白裂解液中充分裂解。將裂解物離心后，收集上清液進行蛋白分析，應(yīng)用BCA蛋白測定試劑盒測量蛋白濃度。取20 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后加入一抗(LC3、Beclin-1、Bcl-2、Bax、p62、p-mTOR、mTOR的稀釋比例均為1 ∶1 000，p-AMPK、AMPK稀釋比例為1 ∶2 000，β-actin稀釋比例為1 ∶10 000)，4 ℃孵育過夜，用PBST清洗干凈后，放入二抗中室溫孵育2 h，用ECL曝光顯色，利用ImageJ軟件分析結(jié)果，檢測蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.6 透射電鏡觀察細胞自噬體將處理的H9c2細胞用2.5%戊二醛固定2 h，然后用1%鋨酸固定液固定2～3 h，最后用0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗15 min，共3次，依次經(jīng)不同濃度梯度的乙醇脫水后，將其包埋在環(huán)氧樹脂中。使用超薄切片儀切成70 nm，并用含3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。透射電鏡觀察拍片。對于自噬體的定量分析，每組檢查10個隨機區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 高糖抑制H9c2細胞自噬如Fig 1所示，與對照組相比，高糖組(17、30 mmol·L-1)H9c2細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1的表達降低，p62表達升高(P<0.01)。透射電鏡觀察細胞自噬體數(shù)目顯示，與對照組相比，高糖組(17、30 mmol·L-1)自噬小體數(shù)目明顯減少(P<0.01)。

2.2 ACh抑制H9c2細胞自噬通過以上實驗，確定高糖濃度30 mmol·L-1用于以下實驗。如Fig 2所示，與對照組相比，高糖(30 mmol·L-1)環(huán)境中H9c2心肌細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1的蛋白表達降低(P<0.01)，p62表達升高(P<0.05)；ACh(10-6、10-5、10-4nmol·L-1)處理，可降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcelin-1表達，增加p62表達(P<0.01)。

2.3 ACh增加高糖誘導的心肌細胞活性Fig 3的MTT結(jié)果顯示，相比于對照組，高糖組細胞活性降低(P<0.01)；相比于高糖組，ACh組細胞活性明顯增加，且ACh濃度大于10-4nmol·L-1差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞內(nèi)ATP含量檢測顯示，相比于對照組，高糖組細胞內(nèi)ATP含量明顯降低(P<0.05)；相比于高糖組，ACh組細胞內(nèi)ATP含量明顯增加，且ACh濃度大于10-4nmol·L-1差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 1 Autophagy in H9c2 cells inhibited by high glucose n=3)

A: Expressions of LC3, Beclin-1, and p62 in cardiomyocytes; B: Transmission electron microscopy (scale bar: 2 μm, red arrow indicates autophagosomes).**P<0.01vscontrol.

2.4 ACh抑制自噬保護高糖誘導的心肌細胞損傷根據(jù)上述細胞活性實驗及ATP含量測定，ACh濃度為10-4nmol·L-1用于以下實驗。Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，相比于對照組，高糖組Bax/Bcl-2比值升高(P<0.01)；相比于高糖組，HG+ACh組及HG+3-MA組Bax/Bcl-2比值均降低(P<0.01)；相比于HG+ACh組，Ach+Rap組Bax/Bcl-2比值反而升高(P<0.01)。

Fig 2 Expressions of LC3, Beclin-1 and p62 in H9c2 cells n=3)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG

Fig 3 H9c2 cell activity under high glucose

A: Relative cell viability in each group; B: Relative ATP content in each group.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG.

Fig 4 Expressions of Bax, Bcl-2 in H9c2 cells n=3)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG;△△P<0.01vsHG+ ACh

2.5 ACh通過AMPK-mTOR信號通路抑制自噬如Fig 5所示，相比于對照組，高糖組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，p-AMPK/AMPK比值下降,p-mTOR/mTOR比值上升(P<0.01)；相比于高糖組，HG+ACh組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，p-AMPK/AMPK比值下降(P<0.01)，而p-mTOR/mTOR比值上升(P<0.01)；相比于HG+Ach組，HG+ACh+AICAR組p-AMPK/AMPK比值上升，而p-mTOR/mTOR比值下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上升(P<0.01)。提示ACh抑制自噬時，伴有p-AMPK/AMPK比值的下降及p-mTOR/mTOR比值的上升，而利用AMPK激活劑AICAR上調(diào)AMPK信號通路，可部分上調(diào)自噬水平。

3 討論

在臨床上，DCM是一個排除性診斷，不易被診斷，當糖尿病患者出現(xiàn)心血管并發(fā)癥，并診斷為DCM時，提示患者預(yù)后差。大量研究已證實,糖尿病可影響糖代謝及脂代謝，從脂質(zhì)毒性、糖毒性、氧化應(yīng)激增強、線粒體功能失常、炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多個方面損傷心肌細胞，導致DCM的發(fā)生發(fā)展。因此，尋找治療DCM新的治療靶點極具意義。有研究表明，自噬參與糖尿病微血管及大血管并發(fā)癥的發(fā)生與進展[2,9-10]，近年來研究發(fā)現(xiàn)，ACh可調(diào)控AMPK途徑介導的細胞自噬，影響心肌細胞凋亡。本實驗成功構(gòu)建了高糖誘導心肌細胞損傷模型，在細胞水平探究了ACh在其中的作用及機制。

與既往的研究一致[6]，本研究再次證實高糖可抑制心肌細胞自噬，利用自噬抑制劑3-MA抑制自噬水平，發(fā)現(xiàn)心肌細胞凋亡水平反而下降，提示高糖抑制細胞自噬對高糖誘導的細胞損傷是一種保護效應(yīng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，ACh可增加高糖狀態(tài)下心肌細胞活性，并伴隨有細胞內(nèi)ATP含量升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ACh抑制自噬水平，作用類似自噬抑制，ACh處理后抑制心肌細胞自噬，可減少高糖誘導的細胞凋亡，而在ACh處理后再利用Rap處理，反而出現(xiàn)了細胞凋亡的增加。而Zhao等[11]的研究表明，ACh可促進缺氧復(fù)氧過程中心肌細胞自噬，減少缺氧復(fù)氧造成的心肌損傷。之所以存在ACh既可抑制心肌細胞自噬，也可促進心肌細胞自噬，我們推測其原因可能與建立的細胞損傷模型不同有關(guān)。生理狀態(tài)下，細胞自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的一種適應(yīng)性機制，在不同的應(yīng)激條件下，自噬水平的高低對細胞存活是一把雙刃劍。因此，可能存在ACh在不同條件下，以不同的方式調(diào)控自噬活性，維持細胞穩(wěn)態(tài)。

Fig 5 Expressions of LC3, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR in H9c2 cells n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG;△△P<0.01vsHG+ ACh

在饑餓、缺血、缺氧、氧化應(yīng)激等營養(yǎng)或能量限制條件下，會誘導自噬水平升高。鑒于葡萄糖剝奪(營養(yǎng)限制條件)能夠誘導自噬，高葡萄糖(營養(yǎng)過剩的條件)會抑制心肌細胞中的自噬并不奇怪。自噬可在胰腺β-細胞中保護其免受糖尿病誘導的氧化損傷，因此，可以理解的是，在本研究中抑制的自噬并不會導致高葡萄糖毒性。相反，這種適應(yīng)性反應(yīng)構(gòu)成了在高葡萄糖暴露期間，促進心肌細胞存活的機制的一部分。支持我們的結(jié)果有，葡萄糖輸注減少了肝臟中的自噬，伴隨著脂多糖誘導的全身性炎癥的減弱[12]。這些結(jié)果強調(diào)了一個事實，即自噬可能是保護性的，也可能是有害的，這取決于細胞類型和細胞環(huán)境。因此，必須單獨確定在不同病理條件下自噬的功能意義。

自噬受哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、NF-κB等眾多信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)，其中mTOR是最重要的一條通路，負向調(diào)控自噬活性。PI3K/Akt與AMPK是mTOR上游的兩條通路, 且相互密切聯(lián)系[13]。抑制PI3K/Akt可降低mTOR的活化，從而促進自噬的發(fā)生[14]，AMPK與之相反[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，ACh是通過抑制AMPK，促進mTOR的活化，從而抑制自噬。

自噬在病理狀態(tài)下作為一種適應(yīng)性應(yīng)激來維持整體的平衡，作為細胞應(yīng)對不良環(huán)境的一種防御機制。目前研究最多的是巨自噬。在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、衰老、心血管疾病、感染等眾多疾病的病理生理過程中，自噬都起了重要作用，調(diào)控自噬可能成為防治相關(guān)疾病潛在靶點之一。本研究發(fā)現(xiàn)，ACh可作為干預(yù)靶點調(diào)節(jié)自噬活性，ACh通過抑制自噬，降低高葡萄糖毒性，進一步推測，ACh可能通過自噬途徑參與眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展。此外，離體細胞模型與體內(nèi)模型存在差異，因此，本課題組擬在糖尿病心肌病動物模型展開進一步研究。

(致謝：本實驗在江西省高血壓研究所完成，在此感謝張婉老師及曾俊義老師在實驗中給予的幫助與支持。)