張婷婷，矯 建，邵純君，劉進朋

(大連市藥品檢驗所藥理室，遼寧 大連 116021)

組織缺氧、缺血、再灌注、氧化應(yīng)激、高滲應(yīng)激等刺激因素，誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡[1]。阿霉素(doxorubicin，DOX)臨床使用時經(jīng)常誘發(fā)患者心臟毒性，主要通過引起終期分化心肌細(xì)胞和心臟祖細(xì)胞凋亡，進而導(dǎo)致心肌組織或固有的再生能力缺失[2-4]。DOX也影響心肌細(xì)胞與肝細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子等的反應(yīng)[5]。心肌肽(cardiomyopeptide，Car)是從乳豬心臟中提取的多肽類活性物質(zhì)，可直接作用于心肌細(xì)胞，預(yù)防和保護心臟缺血/再灌注等多種因素下心肌損傷的修復(fù)[6]，臨床試驗也表明，其具有良好的心肌保護作用[7]。2005年，心肌肽被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為一類化學(xué)藥，用于心臟外科手術(shù)圍術(shù)期心肌保護的輔助藥物。本實驗采用DOX損傷H9c2心肌細(xì)胞，研究心肌肽的保護作用及對胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP-3)等蛋白表達的影響，揭示其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細(xì)胞系大鼠心肌細(xì)胞株H9c2細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 藥物與試劑心肌肽(大連珍奧藥業(yè)有限公司，批號：20170401、20170302、20170103)；鹽酸阿霉素(美國MCE公司)；胰蛋白酶、增強化學(xué)發(fā)光液(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；MTT、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國Solarbio公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、IP細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(碧云天生物技術(shù)研究所)；兔源一抗Bax、Bcl-2、caspase-3、IGF-1R、IGFBP-3、β-actin(美國Proteintech公司)；兔源二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器H-1650離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；超純水裝置(美國Cascada)；CF16RX高速冷凍離心機、U-3010紫外可見分光光度計(日本HITACHI)；酶標(biāo)儀(美國Thermo)；DYCZ-40D轉(zhuǎn)印電泳儀(北京市六一儀器廠)；JM-250型電泳儀(大連競邁生物科技有限公司)；UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國BioSpectrum)；TE2000-U顯微鏡(日本Nikon)；CCL-170B-8型CO2培養(yǎng)箱(新加坡ESCO)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

2.2 MTT法測定心肌細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以1×108·L-1細(xì)胞濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，孵育24 h后分組，各組均設(shè)6個復(fù)孔。實驗組加入心肌肽使?jié)舛确謩e為0、10、20、40 mg·L-1，預(yù)處理6、8、12 h后，與模型組同時加入DOX(終濃度為1 μmol·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，4 h后吸除培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，搖床上低速振搖10 min，使結(jié)晶充分溶解后，在570 nm處測定吸光度，計算細(xì)胞存活率。同時考察40 mg·L-1心肌肽預(yù)處理8 h，對DOX半抑制濃度(IC50)的影響。按照以下公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=實驗組吸光度值/正常對照組吸光度值×100%。

2.3 Western blot測定蛋白表達以1×108·L-1濃度將細(xì)胞接種到6孔板中，24 h后，加入心肌肽(0、10、20、40 mg·L-1)預(yù)處理8 h，再分別加入DOX(終濃度為1 μmol·L-1)，24 h后吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，用冷PBS洗滌2次，吸除殘留液體；胰酶消化，將收集到的細(xì)胞置1.5 mL離心管內(nèi)，PBS洗滌2次，每孔加入IP裂解液100 μL，充分吹打，置于4 ℃下裂解15 min后，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，蛋白含量測定后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%和12.5%的SDS-PAGE分離。濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)到PVDF膜上，封閉3 h，TBS-T洗滌3次，每次10 min。加入一抗，4 ℃冰箱孵育過夜后，TBS-T洗滌3次，每次10 min。加入相應(yīng)的二抗孵育3 h，TBS-T洗滌3次，每次10 min，用ECL Western blot檢測系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析，檢測蛋白表達情況。

3 結(jié)果

3.1 心肌肽對H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響如Fig 1所示，與DOX組相比，心肌肽10 mg·L-1預(yù)處理12 h，細(xì)胞存活率提高(10.1±3.8)%；心肌肽濃度為20 mg·L-1時，細(xì)胞存活率提高(13.9±3.7)%(8 h)和(25.5±3.3)%(12 h)；心肌肽濃度為40 mg·L-1時，細(xì)胞存活率提高(12.6±2.4)%(6 h)、(25.6±2.0)%(8 h)和(34.3±6.0)%(12 h)，均可明顯提高細(xì)胞存活率(P<0.05)。結(jié)果表明，心肌肽可以保護受損的心肌細(xì)胞，對細(xì)胞保護作用呈時間和劑量依賴性。

如Fig 2所示，心肌肽40 mg·L-1預(yù)處理8 h，可使DOX的IC50值由(1.2±0.4)μmol·L-1右移至(2.3±0.2)μmol·L-1(P<0.01)。提示心肌肽預(yù)處理可減輕DOX的細(xì)胞毒性，并促進細(xì)胞增殖。

Fig 1 Effect of cardiomyopeptide on DOX-induced apoptosis in H9c2 cardiac

*P<0.05vsDOX group

Fig 2 Effect of cardiomyopeptide on dose-dependent

3.2 心肌肽對Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達的影響如Fig 3結(jié)果顯示，與對照組相比，DOX組Bax和caspase-3蛋白表達量增加(P<0.01)。心肌肽(20、40 mg·L-1)預(yù)處理H9c2細(xì)胞8 h，隨著藥物濃度的增加，Bax和caspase-3蛋白表達量降低，Bcl-2蛋白表達量增加(P<0.01)。表明心肌肽通過增加Bcl-2表達，抑制caspase-3活性發(fā)揮抗凋亡活性。

3.3 心肌肽對IGF-1R和IGFBP-3表達的影響如Fig 4所示，與對照組相比，DOX組IGFBP-3蛋白表達量增加，而IGF-1R蛋白表達量減少(P<0.05)。心肌肽40 mg·L-1預(yù)處理8 h，可明顯增加IGF-1R表達(P<0.05)，而經(jīng)心肌肽(20、40 mg·L-1)預(yù)處理8 h的H9c2細(xì)胞，IGFBP-3蛋白表達減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性。表明心肌肽保護DOX引起的心肌細(xì)胞損傷作用可能與調(diào)節(jié)IGF-1系統(tǒng)有關(guān)。

Fig 3 Effect of cardiomyopeptide on the expression of Bcl-2,Bax and caspase-3 under doxorubicin treatment in H9c2

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDOX group

Fig 4 Effect of cardiomyopeptide on the expression of IGF-1R and IGFBP-3 caused by doxorubicin in H9c2

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsDOX group

4 討論

細(xì)胞凋亡通常是由于線粒體滲透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，caspase-3被激活引起。大量結(jié)果表明，Bcl-2和Bax在凋亡通路中有重要作用[8]，Bcl-2可與Bax形成異源二聚體，阻止Bax向線粒體移位，減少線粒體通透性，抑制Bax的促凋亡作用[9]。Bcl-2作為抗凋亡因子，其同源二聚體可以維持線粒體的穩(wěn)態(tài)，而且Bax同源二聚體可以直接激活caspase-3。Bcl-2和Bax基因在凋亡過程中是功能對立的重要調(diào)控基因，caspase-3是凋亡過程中重要的執(zhí)行蛋白酶，Bcl-2、Bax通過調(diào)控caspase-3活性而發(fā)揮抗凋亡作用[10]。IGF-1具有多重細(xì)胞生物學(xué)作用，包括促細(xì)胞生長、分化及抗凋亡作用，是心肌細(xì)胞重要的生長、生存因子，能調(diào)節(jié)人或?qū)嶒瀯游锏男呐K功能，如改善DOX引起的心肌病變和在心肌缺血、心衰實驗?zāi)Ｐ椭袦p少心肌細(xì)胞死亡。

IGF-1減少0.5 μmol·L-1DOX引起的細(xì)胞凋亡[11]，但對1 μmol·L-1DOX無效[12]。在無血清培養(yǎng)基或DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡實驗中，IGF-1抗凋亡作用與Bax表達、caspase-3活性和DNA裂解有關(guān)，IGF-1通過減少Bax表達和抑制caspase-3活性，提高細(xì)胞存活率[13]。IGF-1缺氧引起的新生心肌細(xì)胞抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達水平增加[14]。DOX通過影響IGF-1系統(tǒng)，使H9c2細(xì)胞的IGF-1R蛋白表達下調(diào)、IGFBP-3上調(diào)，IGFBP-3也通過IGF-1非依賴機制引起細(xì)胞凋亡[13]。N-乙酰半胱氨酸、右丙亞胺和卡維地洛等抗氧化劑預(yù)處理后，也通過調(diào)節(jié)IGF-1系統(tǒng)，發(fā)揮抗凋亡作用[15]。

本實驗結(jié)果表明，心肌肽40 mg·L-1預(yù)處理8 h，可明顯對抗1 μmol·L-1DOX引起的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞存活率提高(25.6±2.0)%。Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，DOX組的促凋亡蛋白Bax表達量明顯增加，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達量減少；心肌肽組可下調(diào)DOX誘導(dǎo)的Bax蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達，抑制caspase-3蛋白活性。進一步觀察了IGF-1R和IGFBP-3蛋白表達，發(fā)現(xiàn)心肌肽可改變DOX對IGF-1系統(tǒng)的影響，使IGF-1R蛋白表達增加，IGFBP-3蛋白表達減少。以上結(jié)果提示，心肌肽可能通過調(diào)節(jié)IGF-1系統(tǒng)，保護DOX所致的心肌細(xì)胞損傷。