鄭紅蕓，吳 越，葉景靜，陳建宏，蔣蓮秀，何 義，黃大林

(1. 桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004；2. 渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，陜西 渭南 714026)

抗生素耐藥性問題變得越來越嚴(yán)重，急需尋求新型抗生素來解決抗生素耐藥這一問題。放線菌作為一類重要的微生物藥用資源，可產(chǎn)生抗生素、抑制劑、酶等，在醫(yī)藥行業(yè)中發(fā)揮著重要作用。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，種類豐富、結(jié)構(gòu)多樣的放線菌不斷被挖掘出來。在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物研究中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)天然生物活性物質(zhì)中有40%分離自放線菌，其中臨床和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的150多種抗生素中，有2/3來自于放線菌[1-2]。作為產(chǎn)生抗生素的最有潛力的生產(chǎn)者，放線菌中的鏈霉菌受到了極大關(guān)注。

普通陸地環(huán)境中的土壤是鏈霉菌獲取的重要途徑，但是隨著人們的不斷挖掘，陸地環(huán)境內(nèi)鏈霉菌的獲取率已經(jīng)越來越低，所以研究者們把研究方向轉(zhuǎn)向了代謝途徑特殊的紅樹林等特殊生境的微生物研究[3]，以此來尋求具有特殊生物活性的新型抗生素類化合物。多個(gè)紅樹林淤泥放線菌研究結(jié)果顯示，鏈霉菌為紅樹林淤泥放線菌的多產(chǎn)菌屬，豐富的鏈霉菌種類大大增加了篩選出藥用資源的機(jī)率。所以本研究地點(diǎn)選擇了研究相對(duì)較少、物種豐富、污染少的廣西茅尾海紅樹林[4]，開展了相關(guān)研究。有研究者在此處獲得了多樣性豐富的放線菌，并且發(fā)現(xiàn)了許多具有抑菌活性的放線菌菌株[5]。本文主要對(duì)廣西茅尾海紅樹林中獲得的3株鏈霉菌從抗菌活性、系統(tǒng)發(fā)育樹和生物學(xué)特征進(jìn)行研究，希望通過本研究為尋找具有開發(fā)價(jià)值的新抗生素提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品 3株分離自廣西茅尾海紅樹林自然保護(hù)區(qū)根圍淤泥中的鏈霉菌。

1.1.2培養(yǎng)基 ① 分離培養(yǎng)基如下：M1(棉子糖組氨酸培養(yǎng)基)：棉子糖5 g、KNO31 g、L-組氨酸1 g、CaCl22 g、NaCl 1 g、MgSO4·7H2O 1 g、K2HPO41 g、瓊脂20 g、海水600 mL、蒸餾水400 mL，pH 7.2；M2(海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基)：海藻糖5 g、脯氨酸1 g、(NH4)2SO41 g、NaCl 1 g、CaCl22 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 1 g、復(fù)合維生素 1 mL、瓊脂18 g、土壤浸汁30 mL、海水500 mL、蒸餾水500 mL，pH 7.2；M3[淀粉酪素培養(yǎng)基(篩選嗜鹽或耐鹽的菌)][6]：可溶性淀粉10 g、干酪素0.3 g、KNO32 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、NaCl 30 g、K2HPO42 g、CaCO30.02 g、FeSO410 mg、瓊脂15 g、土壤浸汁30 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2；M4(ISP5培養(yǎng)基)：L-天門冬酰胺1 g、甘油10 g、K2HPO41 g、微量鹽1 mL、瓊脂15 g、土壤浸汁30 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。② 純化選用培養(yǎng)基：ISP2固體培養(yǎng)基。③ 發(fā)酵選用培養(yǎng)基：ISP2液體培養(yǎng)基。④ 藥敏試驗(yàn)菌株選用培養(yǎng)基：腸球菌耐藥株2800(Enterococcusfaecalis)選用BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)。Mueller-Hinton(M-H)培養(yǎng)基(英國(guó)OXOID)用于培養(yǎng)其他藥敏試驗(yàn)菌株。

1.1.3抑制劑 抑制劑分別為放線菌酮50.0 mg·L-1，重鉻酸鉀25.0 mg·L-1，萘啶酮酸25.0 mg·L-1

1.1.4藥敏試驗(yàn)測(cè)試菌株 腸球菌耐藥株2800，由廣東汕頭大學(xué)提供；銅綠假單胞菌敏感株ATCC27853和耐藥株2774、金黃色葡萄球菌敏感株ATCC29213和耐藥株ATCC43300、肺炎克雷伯菌敏感株ATCC10031和耐藥株ATCC700603、大腸埃希菌敏感株ATCC25922、糞腸球菌敏感株ATCC33186和耐藥株VRE310681、鮑曼不動(dòng)桿菌敏感株ATCC19606和耐藥株2799，均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供。

1.1.5試劑與儀器 DNA提取用Chelex100樹脂，購于美國(guó)Bio-Rad公司；2×EasyTaq Supermix、放線菌酮，購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；萘啶酮酸與PCR引物(27F, 1492R)，購于上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Autoclave MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋(日本Sanyo公司)；PCR擴(kuò)增儀Veriti96 well fast thermal cycler(美國(guó)Applied Biosystems公司)；YT-CJ-1ND超凈工作臺(tái)(北京亞泰科隆儀器有限公司)；小型離心機(jī)Centrifuge1-14(德國(guó)Sigma公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀OSB-2100(日本EYELA公司)；電泳儀DYY-6C(北京市六一儀器廠)；全恒溫培養(yǎng)箱ZDP-2120、旋轉(zhuǎn)式搖床ZHWY111C(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1土樣制備 參考吳越等[7]的土壤處理方式，將新鮮海泥放于無菌平皿中，室溫條件超凈臺(tái)內(nèi)自然風(fēng)干后，用無菌研缽將干泥塊研磨成細(xì)粉末狀。分別稱取5 g不同地點(diǎn)的粉末，于45 mL(含有無菌玻璃珠)無菌水中溶解，180 r·min-1、28 ℃搖床振蕩6 h；吸取1 mL土樣溶解懸液于9 mL無菌水中，然后稀釋成4個(gè)梯度，分別為100、10、1、0.1 g·L-1，選擇終濃度為10、1、0.1 g·L-1，分別吸取0.2 mL于4種不同分離培養(yǎng)基平皿上，進(jìn)行涂布，完成后，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期觀察平板內(nèi)菌落的生長(zhǎng)情況。

1.2.2菌株的分離與保存 連續(xù)培養(yǎng)2～8周后，觀察菌落的形態(tài)及生長(zhǎng)情況。肉眼判斷觀察后，挑取形態(tài)似放線菌的菌落，用竹簽挑取單個(gè)菌落于改良ISP2固體培養(yǎng)基，并三區(qū)劃線，以得到純化的單菌落。同時(shí)，將菌株以無菌的20%甘油作為保護(hù)劑,置于-80 ℃冰箱保存，以20%無菌脫脂牛奶作為保護(hù)劑，冷凍干燥后，置4 ℃冰箱保藏。

1.2.316S rRNA基因序列的測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 ① 采取Chelex-100法提取基因組DNA[8]。擴(kuò)增引物為通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。總體積為50 μL的PCR反應(yīng)體系：27F(10 μmol·L-1)1.5 μL，1492R(10 μmol·L-1)1.5 μL，模板2.5 μL，2×Easy taq supermix 25 μL，無菌水19.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。② PCR產(chǎn)物選用1%瓊脂糖凝膠110 V、30 min電泳檢測(cè)；將篩選出的陽性結(jié)果交由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。③登錄http://www.ezbiocloud.net/identify和NCBI數(shù)據(jù)庫，對(duì)測(cè)序所獲16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比對(duì)。分別選取相似性較高且有效發(fā)表菌株的16S rRNA基因序列作為參比對(duì)象，然后采用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)[9]，用MEGA 7.0軟件[10]通過鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行聚類分析，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹[11]的構(gòu)建，系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Kimura-2[12]模型估計(jì)，重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值(Bootstrap value)分析，以此來評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性。

1.2.4發(fā)酵粗提物抗菌活性檢測(cè)

1.2.4.1檢定樣品的制備 挑取生長(zhǎng)3～4 d的菌株，于裝有130 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，接種3瓶，搖床180 r·min-1，溫度28 ℃培養(yǎng)6～7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液4 500 r·min-1離心30 min，留取發(fā)酵粗提物30 mL到樣品瓶中，剩余部分選用等體積的乙酸乙酯萃取，酯相(E1-3)旋蒸濃縮干燥后，用3 mL甲醇溶于樣品瓶中備用。留取萃取后的水相(A1-3)60 mL，揮發(fā)干燥后，用3 mL 1 ∶1甲醇水溶液溶解后備用。丙酮浸泡菌體(M)24 h后，采用與水相制備相同的方法。

1.2.4.2藥敏試驗(yàn)測(cè)試菌株的配制 將平皿上的藥敏試驗(yàn)菌株分別接種于裝有20 mL MH與BHI液體培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，搖床設(shè)置36 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)12 h，將菌懸液按0.8%濃度，加入到溫度降至55 ℃左右無菌MH和BHI瓊脂培養(yǎng)基中，搖勻，使其終濃度為0.5麥?zhǔn)蠞舛葐挝?，以每?5～20 mL傾倒至培養(yǎng)皿內(nèi)，置4 ℃冰箱備用。

1.2.4.3樣品抗菌活性篩選 選用牛津杯法，將200 μL發(fā)酵粗提物加入到含有藥敏試驗(yàn)測(cè)試菌株的平皿內(nèi)，36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～18 h。采取紙片擴(kuò)散法，將直徑為6 mm、厚度為2 mm的圓形無菌濾紙片上，滴加60 μL已制備完成的E、A、M3類樣品，待其揮發(fā)干燥后，貼于含有測(cè)試菌的培養(yǎng)皿上，36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24 h后，觀察并測(cè)量抑菌圈的大小。

2 結(jié)果

2.1 抗菌活性利用藥敏試驗(yàn)測(cè)試菌株對(duì)未經(jīng)濃縮的發(fā)酵粗提物采用牛津杯法進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，菌株K51M對(duì)金黃色葡萄球菌敏感株與耐藥株均具有明顯的抑菌作用，抑菌圈大小分別為13.1 mm和9.6 mm(Fig 1)，其余兩株鏈霉菌未出現(xiàn)抑菌圈。

Fig 1 Antibacterial activity of crude fermentation extract(K51M)

A:Antimicrobial activities of strain K51M against Staphylococcus aureus sensitive strain by Oxford cup method; B:Antimicrobial activities of strain K51M against Staphylococcus aureus resistant strain by Oxford cup method.

將發(fā)酵液濃縮后，采用紙片法進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示(Tab 1)，菌株K57M對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均具有較好的抑菌活性。菌株K131M對(duì)大多數(shù)藥敏菌株產(chǎn)生了明顯的抑菌作用，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌敏感株和銅綠假單胞菌的抑菌活性更強(qiáng)；而菌株K51M對(duì)革蘭陽性測(cè)試菌都表現(xiàn)出了較好的抗菌活性(Fig 2)。

2.2 菌落特征經(jīng)選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，3株菌均在改良ISP2培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，并且菌落緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，干燥、多皺褶，具有典型的放線菌形態(tài)。其中K57M菌落開始呈現(xiàn)白色，后逐漸生長(zhǎng)為灰白色，布滿孢子絲，質(zhì)地較密，且不易被挑取。K131M質(zhì)地較密，菌落為黃色，白色孢子絲布滿菌落，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，極易挑起；K51M菌落開始為灰白色，后面孢子產(chǎn)生孢子絲布滿菌落，但孢子絲不易散落，菌落可使培養(yǎng)基著色，觀察培養(yǎng)基顏色變化發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生可溶性灰褐色色素，并且菌落不容易從培養(yǎng)基上挑取(Fig 3)。

2.3 基于16S rRNA構(gòu)建3株放線菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹測(cè)序獲得3株菌株的16S rRNA基因序列后，登錄Ezbiocloud進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選取相似性較高的菌株序列作為參比對(duì)象(Fig 4)。

Tab 1 Screening results of antimicrobial activity of strains K57M, K131M and K51M(mm)

Gram-positive bacteria (S.a: Staphylococcus aureus, E.f: Enterococcus faecalis); Gram-negative bacteria (P.a: Pseudomonas aeruginosa; E.c: Escherichia coli; K.p: Klebsiella pneumoniae; A.b: Acinetobacter baumannii). S: Sensitive strain; R: Resistant strain.

Fig 2 Partial results of antibacterial activity of three Streptomyces strains

A:Antibacterial activities of Klebsiella pneumoniae sensitive strain; B and C:Antibacterial activities of Staphylococcus aureus sensitive strain.

Fig 3 Colony morphology of three strains of Streptomyces on culture medium and under macroscopic stereomicroscope

從比對(duì)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，菌株K57M與菌株StreptomycespolymachusKM229363 T258T的相似率為98.30%，在N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹中，與部分有效發(fā)表的菌株形成一簇，并且形成了獨(dú)立的進(jìn)化分支，說明菌株K57M極有可能為鏈霉菌屬內(nèi)潛在的新種，接下來將開展多相分類學(xué)相關(guān)的研究。菌株K51M在系統(tǒng)進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)，其與鏈霉菌屬中的不產(chǎn)色鏈霉StreptomycesachromogenesAB184109 NBRC 12735T的序列最為相近，相似率為99.09%，初步判斷其可能為這個(gè)種的變種。菌株K131M比對(duì)結(jié)果顯示其相似率為99.87%，在進(jìn)化樹分支中可信度較高，提示可能為Streptomycescoeruleoprunus下的一個(gè)變種。

3 討論

紅樹林是位于熱帶與亞熱帶潮帶間的植物群落，物種多樣性造就了豐富的微生物資源[13]。目前，紅樹林活性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。放線菌作為紅樹林生境中一組特殊的微生物群落，從中挖掘到的放線菌新物種越來越多，根據(jù)不同生態(tài)環(huán)境分為植物內(nèi)生、陸地、海洋放線菌[14]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，從紅樹林淤泥中篩選得到的的放線菌多于植物內(nèi)生放線菌[15]，其中鏈霉菌屬和小單孢菌屬是紅樹林淤泥放線菌中的優(yōu)勢(shì)菌屬，并且種類豐富。紅樹林淤泥放線菌中的優(yōu)勢(shì)菌屬鏈霉菌屬于高G+C含量的有機(jī)化能好氧型革蘭陽性放線菌，不僅種類豐富，而且近年來大多數(shù)抗菌、抗腫瘤的次級(jí)活性產(chǎn)物主要來源于鏈霉菌。如Yu等[16]從1株來源于廈門紅樹林的鏈霉菌屬中獲得了1個(gè)新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有抗真菌及抗腫瘤的作用；Zhang等[17]從1株鏈霉菌中分離獲得了2個(gè)新化合物，并且檢測(cè)到對(duì)大腸桿菌能夠產(chǎn)生較好的抗菌活性。因此，來源于紅樹林的鏈霉菌具有潛在的研究及開發(fā)價(jià)值。

Fig 4 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16Sr RNA gene sequences of three strains of genus Streptomyces

廣西茅尾海紅樹林自然保護(hù)區(qū)為省級(jí)紅樹林自然保護(hù)區(qū)，占據(jù)著獨(dú)特的地理環(huán)境[18]，其紅樹群落較為簡(jiǎn)單，主要為桐花樹、桐花樹-無瓣海桑群落，還有伴生植物-互花米草。此次就廣西茅尾海的3株鏈霉菌進(jìn)行生物特征研究及活性鑒定，發(fā)現(xiàn)這3株菌株的抗菌活性具有一定的對(duì)比差異性。首先，菌株K57M在測(cè)序比對(duì)后，通過構(gòu)建進(jìn)化樹，初步鑒定為潛在的鏈霉菌屬內(nèi)的新物種，并且對(duì)金黃色葡萄球菌敏感株和銅綠假單胞菌耐藥株產(chǎn)生了抑菌活性，說明其抗菌能力較為窄譜；其次，菌株K131M對(duì)于藥敏試驗(yàn)測(cè)試菌株具有廣譜抗菌活性，且抑菌活性較好；再者，菌株K51M通過牛津杯試驗(yàn)和紙片法試驗(yàn)，均表現(xiàn)出了較好的抗菌能力，特別是紙片擴(kuò)散法篩選結(jié)果顯示，它對(duì)于革蘭陽性與革蘭陰性菌均具有較好的抑菌作用，說明其抗菌能力較為廣譜。通過統(tǒng)計(jì)可以看出，這3株菌株對(duì)金黃色葡萄球菌均產(chǎn)生了較好的抑菌活性，而且在致病菌種類和抗菌能力上均有所不同。這也為我們篩選特異性次級(jí)代謝產(chǎn)物提供了一定的基礎(chǔ)和微生物來源。

紅樹林豐富的鏈霉菌及大量的研究結(jié)果表明，該屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物仍然具有巨大的研究潛力。通過對(duì)廣西茅尾海紅樹林根圍淤泥中放線菌研究發(fā)現(xiàn)，其資源豐富，鏈霉菌種類多樣，這不僅為新活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的篩選提供了微生物資源，同時(shí)為微生物來源的新型抗生素的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所孫承航老師實(shí)驗(yàn)室完成，特別感謝實(shí)驗(yàn)室老師及同學(xué)的指導(dǎo)與幫助！)