劉夢(mèng)茹，王雅琪，張 偉，姚富榮，蒼 林， 柴文戍

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧 錦州 121000；2. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 青島 266000；3.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是院內(nèi)感染最常見(jiàn)的一種革蘭陰性機(jī)會(huì)致病菌，易感人群主要為肺囊性纖維化[1]、慢性阻塞性肺疾病[2]、腫瘤[3]、獲得性免疫缺陷癥等免疫力低下的患者。近年來(lái)，PA已經(jīng)成為醫(yī)院感染高患病率和致死率最常見(jiàn)的致病因子之一，且耐藥率呈逐年上升的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)選取PA作為研究對(duì)象，意圖探明其對(duì)免疫細(xì)胞的作用機(jī)制，從而為治療其感染尋找新的靶點(diǎn)。

來(lái)自于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞是被招募到炎癥部位的主要先天免疫細(xì)胞。在機(jī)體發(fā)生感染導(dǎo)致局部炎癥產(chǎn)生后，這些被招募到炎癥部位的巨噬細(xì)胞在炎癥的發(fā)生、擴(kuò)散和消退過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，巨噬細(xì)胞增殖能力降低，減弱了巨噬細(xì)胞吞噬病原體的能力，造成持續(xù)感染，損傷肺組織[4]。巨噬細(xì)胞的增殖與凋亡在感染過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，因此，探討PA上清液對(duì)巨噬細(xì)胞增殖抑制、凋亡的影響是控制PA感染機(jī)體的關(guān)鍵。

Krupple樣因子6(Krupple-like factor 6，KLF6)是Kruppel樣C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，參與多種細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程[5]。KLF6在炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，有報(bào)道表明，KLF6與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)之間是有作用聯(lián)系的。iNOS通常不在細(xì)胞中表達(dá)，在巨噬細(xì)胞中，通常是由一些病原體或者細(xì)胞因子刺激，誘導(dǎo)iNOS合成并產(chǎn)生一氧化氮(NO)，破壞細(xì)胞穩(wěn)定，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也可導(dǎo)致周圍組織損傷[6-7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PA可誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞中KLF6的表達(dá)，并可能通過(guò)調(diào)控iNOS，介導(dǎo)肺組織細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)以小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7為研究對(duì)象，探討PA上清液對(duì)RAW264.7凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)KLF6及iNOS在此過(guò)程中的表達(dá)情況。

1 材料

1.1 細(xì)胞株與菌株RAW264.7細(xì)胞，北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管病研究所贈(zèng)予。PA為標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853，來(lái)自錦州醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(PAN)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；MTT、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京索萊寶科技有限公司); Hoechst 33342染色液(萬(wàn)類生物科技有限公司)。

1.3 儀器流式細(xì)胞儀、成像儀(美國(guó)BD Biosciences公司)；半干轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代RAW264.7細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM中，5% CO2、37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每1～2 d半量更換培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，按1 ∶5傳代培養(yǎng)。

2.2 菌株、細(xì)菌培養(yǎng)及細(xì)菌上清液的制備將細(xì)菌株復(fù)蘇后，取血瓊脂平板上單個(gè)PA菌落，接種于8 mL的大豆肉湯培養(yǎng)基中，通過(guò)振顫法(37 ℃，8 h)對(duì)PA進(jìn)行增菌，獲取OD600=1的濃度的菌液，然后1 600×g離心15 min，獲得上清液，用孔徑0.22 μm的濾膜過(guò)濾，最后滅活(56 ℃、1 h),儲(chǔ)存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MTT檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞增殖將RAW264.7細(xì)胞按照13 000個(gè)/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。24 h后，分為陰性對(duì)照組(只加細(xì)胞)、PA上清感染組(體積比為0.15、0.3、0.45的PA上清液與培養(yǎng)基的混合液)，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別培養(yǎng)6、12、24 h后，每孔加入20 μL MTT染色液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀在560 nm測(cè)定每孔的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值)×100%。

2.4 Hoechst 33342染色RAW264.7細(xì)胞以1.8×105個(gè)/孔接種于12孔板中，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別加入體積比為0.15、0.30、0.45的PA上清液與培養(yǎng)基的混合液，以24 h為檢測(cè)點(diǎn)，吸盡培養(yǎng)液，加入300 μL固定液固定15 min，PBS洗5 min，加入300 μL Hoechst 33342染液，室溫孵育15 min，PBS洗滌3遍，每次5 min。隨后在Cytation3細(xì)胞成像多功能檢測(cè)儀20×微米級(jí)分辨率，觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜，按濃度梯度加入PA上清液，對(duì)照組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞，24 h為檢測(cè)點(diǎn)。離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌1次，加入Binding buffer 100 μL重懸細(xì)胞，每管加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，避光室溫反應(yīng)10～15 min。檢測(cè)前，加入10 μL PI staining solution，1 h內(nèi)檢測(cè)完畢。

2.6 Western blot檢測(cè)KLF6及iNOS的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)、分組和干預(yù)同“2.5”，另設(shè)體積比為0.3的PA上清液與培養(yǎng)基混合液，分別作用12、24 h，收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上充分裂解，提取總蛋白。按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，10% SDS-PAGE分離蛋白，用電轉(zhuǎn)儀半干法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。加入1 ∶1 000稀釋的β-actin一抗，1 ∶500稀釋的KLF6一抗，1 ∶1 000稀釋的iNOS一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次10 min，再加入1 ∶10 000稀釋的二抗孵育1.5 h。最后滴入超敏ECL顯影并曝光。以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白的條帶灰度值之比表示各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 PA上清液對(duì)RAW24.7細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 1的MTT結(jié)果顯示，在12、24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，PA上清液組細(xì)胞增殖抑制率均明顯增加(P<0.01)。不同濃度上清液組之間比較，細(xì)胞增殖抑制率隨著濃度的增加而增加(P<0.01)。24 h不同濃度上清液組組與12 h組比較，細(xì)胞增殖抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(P<0.01)。說(shuō)明PA上清液能明顯抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖，抑制效應(yīng)呈濃度-時(shí)間依賴關(guān)系。

Fig 1 Effect of PA supernatant on proliferation inhibitory rate of RAW 264.7 n=3)

**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vs0.15 group;▲▲P<0.01vs0.3 group;##P<0.01vs12 h group

3.2 PA作用RAW264.7細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化經(jīng)Hoechst 33342染色后，對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色圓形或橢圓形，染色體均勻一致；經(jīng)不同體積濃度比的PA上清液處理RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞核固縮，深染，核內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的塊狀顆粒，這些細(xì)胞核形態(tài)變化均為細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)，其中以0.45的PA上清液處理組最為明顯，見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Effect of PA supernant on Cytation3 cell imaging multi-function detector of RAW264.7

A: Control；B: 0.15；C: 0.3；D: 0.45. Red arrow refers to apoptotic cells

3.3 PA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡Fig 3的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞與不同濃度的PA上清液作用24 h后，與對(duì)照組相比，RAW264.7細(xì)胞的凋亡率隨著PA上清液濃度的增高而增加(P<0.05)，0.3濃度PA上清液組與0.15濃度PA上清液組比較，細(xì)胞凋亡率有明顯增加(P<0.01)。與0.15、0.3濃度PA上清液組比較，0.45濃度PA上清液組細(xì)胞凋亡率均有明顯增加(P<0.01)。提示PA上清液增加RAW264.7細(xì)胞凋亡比例呈濃度依賴性。

3.4 PA上清液促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞KLF6及iNOS的表達(dá)如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，PA上清液組能夠以濃度依賴性的方式增加KLF6蛋白表達(dá)(P<0.05)，同時(shí)iNOS表達(dá)增加(P<0.01)；與0.15濃度PA上清液組比較，0.3濃度PA上清液組KLF6表達(dá)增加(P<0.05)，iNOS表達(dá)增加(P<0.01)；與0.15、0.3濃度PA上清液組比較，0.45濃度PA上清液組KLF6表達(dá)增加(P<0.05)，iNOS表達(dá)增加(P<0.01)；尤以0.45濃度PA上清液組變化明顯。如Fig 5所示，0.3濃度PA上清液組分別作用12、24 h后，與對(duì)照組相比，12 h組、24 h組KLF6、iNOS表達(dá)水平均明顯增加(P<0.05，P<0.01)，24 h組與12 h組比較，KLF6及iNOS表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；以24 h實(shí)驗(yàn)組變化更為明顯。

Fig 3 Effect of PA supernatant on apoptosis

*P<0.05vscontrol;△△P<0.01vs0.15 group;▲▲P<0.01vs0.3 group

4 討論

PA是引起院內(nèi)感染致死率較高的最主要病原體之一，PA的毒力因子能夠抵消宿主防御，并且能對(duì)宿主組織造成直接損害或提高細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)力，誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生急、慢性感染。

Fig 4 KLF6 and iNOS protein expression in RAW264.7 cells treated with different volume concentrations

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vs0.15 group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vs0.3 group

Fig 5 KLF6 and iNOS protein expression at different time in RAW264.7 cells treated with PA n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vs12 h group

加之近年來(lái)，由于PA對(duì)越來(lái)越多的抗生素產(chǎn)生耐藥性，因此，研究PA對(duì)免疫細(xì)胞的作用機(jī)制對(duì)PA感染的治療有重要作用。本研究結(jié)果顯示，PA上清液能夠明顯抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖，說(shuō)明PA的致病機(jī)制可能是通過(guò)抑制機(jī)體的免疫細(xì)胞，從而抑制了機(jī)體的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體或局部的炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，遷延不愈。

迄今為止，關(guān)于PA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制有了廣泛的研究。3種主流的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)途徑相關(guān)的凋亡相關(guān)基因主要包括Fas配體(FasL)、Bax和Bcl-2。其中，F(xiàn)asL是一種能夠與死亡受體Fas結(jié)合，并介導(dǎo)細(xì)胞毒性誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的配體[9]。Bcl-2能夠抑制細(xì)胞凋亡，然而，Bcl-2也通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。Bax抑制Bcl-2活性，并拮抗其抗細(xì)胞凋亡作用[11]。但目前關(guān)于KLF6和iNOS在PA對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡方面的研究甚少。

近年來(lái)，對(duì)于KLF6在炎癥調(diào)節(jié)方面的作用研究較多。例如KLF6能夠直接與iNOS啟動(dòng)子形成KLF6-DNA復(fù)合物，調(diào)控iNOS表達(dá)釋放NO，破壞細(xì)胞的穩(wěn)定性，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，參與病毒感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，下調(diào)上皮細(xì)胞中KLF6基因的表達(dá)后，iNOS表達(dá)減少，NO活性降低，減輕了氣道高反應(yīng)，并延緩了炎癥的發(fā)展[12]。早在1994年，Kamijo等[13]就已經(jīng)證實(shí)，巨噬細(xì)胞可通過(guò)iNOS表達(dá)的增加，激活NO的釋放。Mgbemena等[12]及王春波等[14]的研究表明，iNOS可轉(zhuǎn)錄生成NO，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，KLF6和iNOS的表達(dá)水平同時(shí)增加是由于PA誘導(dǎo)增加了KLF6的表達(dá)，而iNOS表達(dá)的上調(diào)是由KLF6誘導(dǎo)的，同時(shí)，iNOS能夠促進(jìn)NO釋放，從而參與細(xì)胞凋亡。這一途徑形成了單核巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞毒性作用的基礎(chǔ)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PA上清液抑制了RAW264.7細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能是由于PA刺激KLF6表達(dá)的增加，從而調(diào)控iNOS的表達(dá)，激活NO的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。KLF6和iNOS可能共同參與了PA上清液誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡。然而，iNOS的表達(dá)是否依賴于KLF6的誘發(fā)，KLF6在PA上清液誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡過(guò)程中是否起決定性作用，還有待于進(jìn)一步研究。本研究為減輕PA感染引起的炎癥反應(yīng)提供了新的理論依據(jù)和研究方向。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在遼寧省錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院完成，感謝各位老師和同學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)與幫助！)