牟登峰,鄭 丹,王 琪,黃仕美,官志忠,于燕妮,樓迪棟

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室；2. 貴陽婦幼保健院圍產(chǎn)期保健科；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)屬于苯丙胺類神經(jīng)興奮劑(amphetamine-typed stimulant，ATS)，俗稱“冰毒”，它具有藥物依賴、中樞神經(jīng)興奮性、致幻、食欲抑制和擬交感效應(yīng)等藥理、毒理學(xué)特性[1]。目前，METH的神經(jīng)毒性作用的損傷學(xué)說主要有以下幾種：神經(jīng)元凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂等[2-4]。其中，線粒體功能及凋亡通路與METH的致病機制越來越受到學(xué)者關(guān)注。有研究認為，線粒體分裂過度或融合不足都會導(dǎo)致線粒體碎裂，降低呼吸作用和能量生產(chǎn)，增加神經(jīng)元損傷和細胞凋亡的可能性[5]。線粒體分裂蛋白1(Fission 1，F(xiàn)is1)的過度表達可以導(dǎo)致線粒體分裂，造成線粒體功能障礙，導(dǎo)致細胞凋亡，藥物抑制分裂可以減輕細胞凋亡[6]。在METH研究中，蔣雷等[7]發(fā)現(xiàn)，METH處理后，短時間內(nèi)神經(jīng)細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)下降，膜通透性轉(zhuǎn)運孔道異常開放，Bax水平上調(diào)，繼而激活caspase-3凋亡蛋白，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。目前，有越來越多的研究者關(guān)注METH致神經(jīng)細胞毒性與線粒體功能紊亂之間的關(guān)系，但相關(guān)機制還未闡明。本實驗擬通過METH作用于體外培養(yǎng)的人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(human neuroblastoma cells，SH-SY5Y cells)，觀察MMP水平、線粒體超微結(jié)構(gòu)及線粒體融合蛋白1(mitofusion 1，Mfn1)和Fis1蛋白表達水平，探索線粒體在METH致體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株人神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y，購自美國Sigma公司。

1.2 試劑與儀器METH(美國Cerilliant公司，標(biāo)準(zhǔn)品編號：M-009，純度：99.9%)；胎牛血清(FBS，美國BI公司)；CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司)；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天公司)；兔抗人Mfn1單克隆抗體、兔抗人Fis1單克隆抗體(美國Abmart公司)；兔抗人β-actin抗體(美國Gene Tex公司)。恒溫細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；ELX800UV酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；DMi8型倒置顯微鏡(德國Leica公司)；H-7650型透射電鏡(日本Hitachi公司)。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖將體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞制成細胞懸液，按1×104/孔的密度接種于96孔板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁長至60%～70%時，換含有METH(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1)的培養(yǎng)液培養(yǎng)，時間為3、6、12、24 h，每組3個復(fù)孔。向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(OD)值，并計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%，取細胞存活率較高的METH處理組進行實驗。采用成組設(shè)計，在含SH-SY5Y細胞的培養(yǎng)液中加入不同濃度的METH(0.0、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1)，濃度的選擇參照文獻[8]以及CCK-8實驗結(jié)果，培養(yǎng)時間分別為3、6、12、24 h。

1.4 JC-1法檢測MMP按照試劑盒說明書操作。使用倒置熒光顯微鏡觀察METH處理SH-SY5Y細胞3、6、12、24 h后的各組細胞的紅、綠熒光，計算機采集熒光圖像，使用Image J軟件重疊紅綠熒光，將合成熒光的光密度比值作為膜電位表達水平值。

1.5 透射電鏡觀察SH-SY5Y細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)收集細胞；將細胞固定于2.5%戊二醛溶液中4 h(4 ℃)，0.1 mol·L-1PBS漂洗；1%鋨酸溶液后固定2 h(4 ℃)，0.1 mol·L-1PBS漂洗；丙酮脫水；Epon812樹脂包埋；切片；醋酸鈾、硝酸鉛染色；上機觀察。

1.6 Western blot法檢測Mfn1和Fis1蛋白表達水平收集METH處理SH-SY5Y細胞3、6、12、24 h后的各組樣本，使用RIPA裂解細胞提取總蛋白，超微量紫外分光光度計檢測各樣本蛋白濃度。經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉2 h后，使用Mfn1(1 ∶1 500)、Fis1(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶5 000)一抗4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h。將PVDF膜與超敏發(fā)光液(ECL)試劑反應(yīng)1 min后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描PVDF膜，Image J軟件分析Mfn1和Fis1蛋白條帶，使用β-actin蛋白條帶校正。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測結(jié)果如Fig 1所示，使用不同濃度的METH處理SH-SY5Y細胞3、6、12、24 h后，METH抑制SH-SY5Y細胞增殖，SH-SY5Y細胞存活率隨METH濃度和作用時間的增加而減小。由于METH濃度>2.0 mmol·L-1時，對應(yīng)的SH-SY5Y細胞存活率較小，故選取1.0、1.5、2.0 mmol·L-1METH處理組作為實驗對象。

Fig 1 Effect of METH on survival rate of SH-SY5Y

2.2 SH-SY5Y細胞MMP水平Tab 1結(jié)果顯示，與對照組比較，各METH處理組MMP紅、綠熒光比值呈明顯降低趨勢。在熒光顯微鏡下，紅色熒光除個別細胞較強外，隨METH濃度升高主要呈下降趨勢；綠色熒光強度隨METH濃度升高主要呈上升趨勢(Fig 2)。

Fig 2 MMP in SH-SY5Y cells cultured in vitro detected by the red-green overlapping fluorescence(×400)

Green arrows indicate the normal MMP, while red arrows indicate the decreased MMP.

2.3 METH對SH-SY5Y細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響如Fig 3所示，透射電鏡下觀察對照組SH-SY5Y細胞線粒體呈橢圓形棒狀雙層膜結(jié)構(gòu)，線粒體嵴正常、清晰；低METH組(1.0 mmol·L-1)SH-SY5Y細胞線粒體膜結(jié)構(gòu)尚完整，部分嵴出現(xiàn)腫脹及斷裂；高METH組(2.0 mmol·L-1)SH-SY5Y細胞線粒體內(nèi)外膜可見破損，線粒體嵴扭曲變形且大量減少或消失，部分空泡化；低、高METH組SH-SY5Y細胞線粒體橢圓形棒狀結(jié)構(gòu)減少，小球狀結(jié)構(gòu)隨之增加。此外，高METH組發(fā)現(xiàn)典型的線粒體自噬過程(Fig 4)。

Tab 1 MMP red-green overlapping fluorescence ratio of SH-SY5Y cells cultured in vitro between control group and METH treatment

*P<0.05vscontrol

Fig 3 Observation of mitochondrial ultrastructure of SH-SY5Y cells by TEM(×4 000)

A: Control group, mitochondria elliptical rod-like structure, normal and clear; B: Low METH group, the mitochondrial elliptical structure splitting into a small spherical structure(arrows); C: High METH group, the mitochondrial globular structure significantly increased(arrows). M: mitochondria; N: nuclei.

Fig 4 Observation of mitochondrial autophagy in SH-SY5Y cells treated with 2.0 mmol·L-1 METH by TEM(A,B: ×8 000; C: ×7 000)

A: Phagocytic vacuoles(arrows) of a nearly spherical double-layered lipid structure, lysosomes of single-layer structure(shown by double arrows); B: Phagocytic vesicles envelop the mitochondria to form mitochondrial autophagy bodies(arrows);C: The lysosome and the autophagosome fuse to form a single-layer structure of autophagosomes(arrows), and the autolysosomal lysosome encapsulates the substance to be dissolved. The substance to be decomposed is deep in degradation, and the substance morphology is difficult to distinguish. M: mitochondria; ER: endoplasmic reticulum.

2.4 METH對Mfn1蛋白表達的影響如Fig 5所示，與對照組比較，METH作用SH-SY5Y細胞3、12、24 h時，Mfn1蛋白表達均降低(P<0.05)；與對照組比較，METH作用SH-SY5Y細胞6 h時，METH(1.5、2.0 mmol·L-1)處理組Mfn1蛋白表達水平均降低(P<0.05)。相同時間內(nèi)，隨著METH濃度的升高，Mfn1蛋白表達水平呈降低趨勢；與相同濃度的METH處理3 h比較，處理12 h時Mfn1蛋白表達呈下降趨勢。

Fig 5 Expression of Mfn1 protein in SH-SY5Y

*P<0.05vscontrol

2.5 METH對Fis1蛋白表達的影響如Fig 6所示，與對照組比較，METH作用SH-SY5Y細胞3、24 h時，F(xiàn)is1蛋白表達均升高(P<0.05)；與對照組比較，METH作用SH-SY5Y細胞6、12 h時，METH(1.5、2.0 mmol·L-1)處理組Fis1蛋白表達水平升高(P<0.05)。相同時間內(nèi)，隨著METH濃度的升高，F(xiàn)is1蛋白表達水平呈升高趨勢；與相同濃度的METH處理3 h比較，處理24 h時Fis1蛋白表達呈上升趨勢。

Fig 6 Expression of Fis1 protein in SH-SY5Y

*P<0.05vscontrol

3 討論

METH具有極強的精神興奮和致幻作用，長期濫用者甚至?xí)霈F(xiàn)精神障礙，METH的致病機制急待探明。研究認為，METH的離子化學(xué)特性可改變電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)電化學(xué)梯度，可影響ATP酶的活性和線粒體膜的完整性[9]。但線粒體形態(tài)及功能在METH致神經(jīng)細胞損傷中的作用仍未闡明。本研究擬通過METH處理SH-SY5Y細胞，觀察線粒體融合與分裂功能及其相應(yīng)的形態(tài)學(xué)改變，觀察線粒體在其發(fā)病機制中的作用。

實驗發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞經(jīng)METH處理后，MMP降低，且與METH的濃度和作用時間有依賴性。而MMP下降是細胞凋亡的一個早期標(biāo)志[10]，可能是我們實驗中METH致SH-SY5Y細胞凋亡的早期信號。我們推測，當(dāng)線粒體受到METH作用時，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)持續(xù)開放，允許小分子通過，使膜兩側(cè)的離子梯度改變，導(dǎo)致線粒體膜電位下降[11-12]，并且允許線粒體內(nèi)的細胞色素C釋放至細胞質(zhì)，啟動細胞凋亡[13]。

同時研究認為，MMP改變會引起細胞線粒體形態(tài)改變。其形態(tài)調(diào)節(jié)受線粒體動態(tài)調(diào)節(jié)蛋白控制，分別為線粒體融合蛋白和分裂蛋白，其中Mfn1和Fis1是主要蛋白，此過程稱為線粒體動態(tài)平衡調(diào)節(jié)[14-15]，是保證膜結(jié)構(gòu)完整的重要條件，也是維持正常膜電位，防止細胞凋亡的重要機制。我們觀察發(fā)現(xiàn)，對照組線粒體超微結(jié)構(gòu)正常；而METH處理組細胞線粒體呈小球狀結(jié)構(gòu)，線粒體內(nèi)外膜破損、嵴破壞，出現(xiàn)吞噬清除損傷的線粒體現(xiàn)象。Twig等[16]認為，線粒體分裂產(chǎn)生兩個不均勻的小體，健康膜部分有較高的膜電位，可再融合；受損膜部分膜電位較低，易被自噬體吞噬。本實驗METH處理細胞表現(xiàn)與Twig等的研究結(jié)果基本一致。我們認為METH處理后，細胞內(nèi)的MMP下降，啟動線粒體分裂，將膜電位較低部分分裂清除，啟動自噬。為進一步證明我們的推測，我們同時檢測了Mfn1和Fis1蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)在SH-SY5Y細胞中，Mfn1蛋白表達量下降，F(xiàn)is1蛋白表達量上升,且與METH處理時間和濃度相關(guān)，表明Mfn1和Fis1蛋白表達調(diào)節(jié)趨勢與METH致細胞MMP下降及分裂現(xiàn)象相一致。這再次證實前面的推測。

綜上所述，過量METH可能通過影響線粒體膜轉(zhuǎn)運蛋白或線粒體膜，致體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞MMP下降，線粒體趨向分裂，啟動自噬和細胞凋亡；線粒體功能紊亂是METH致神經(jīng)毒性的重要機制之一。