李曉曼，吳媛媛，王愛云，陳文星，陸 茵

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理系，江蘇 南京 210023；2. 江蘇省中藥藥效與安全性評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多基因參與的過程，抑癌基因和癌基因是目前腫瘤基因治療研究的熱點(diǎn)。DLC2(deleted in liver cancer 2)是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其在多種腫瘤中缺失或者低表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和侵襲、細(xì)胞干性、血管生成等方面發(fā)揮重要作用。最近對其作用機(jī)制深入研究發(fā)現(xiàn)，DLC2可通過競爭性內(nèi)源RNA (competive endvgenous RNAs, ceRNAs)機(jī)制與其他轉(zhuǎn)錄體相互調(diào)控，該機(jī)制進(jìn)一步拓寬了DLC2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。該文針對DLC2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制進(jìn)行綜述，為DLC2抑癌作用機(jī)制深入研究，以及將DLC2應(yīng)用于抗腫瘤治療的靶點(diǎn)提供一定的思路。

1 DLC2的結(jié)構(gòu)與功能

DLC2最初由Ching等[1]于2003年通過代表性差異分析方法，從肝臟組織中克隆獲得的抑癌基因，該基因位于染色體13ql2.3。其編碼的DLC2蛋白屬于DLC蛋白亞家族，該亞家族有3個(gè)成員：DLC1、DLC2和DLC3，它們具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)域：SAM(sterile alpha motif)、Rho GTP酶激活蛋白(Rho GTPase-activating protein, RhoGAP)和START (StAR-related lipid-transfer)。見Fig 1。

SAM結(jié)構(gòu)域位于N′末端，屬較保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，廣泛地存在于從酵母到人類的各種生物。一般認(rèn)為，蛋白分子借助于SAM結(jié)構(gòu)域相互作用，形成同源或異源的寡聚體，即該結(jié)構(gòu)域通常作為蛋白作用元件發(fā)揮其生物學(xué)功能。而DLC2的SAM結(jié)構(gòu)域與其他已知的SAM結(jié)構(gòu)域同源性低，一般以單體形式存在，DLC2自締合也不依賴SAM結(jié)構(gòu)域。此外，DLC2的SAM結(jié)構(gòu)域還有結(jié)合脂類的功能[2]。

保守的RhoGAP結(jié)構(gòu)域，位于DLC蛋白的中間部分，是DLC最重要的功能區(qū)，因此，DLC亞家族屬于RhoGAPs蛋白家族。該結(jié)構(gòu)域主要功能是作為細(xì)胞內(nèi)分子開關(guān)，調(diào)控Rho GTP酶的活性，將活化的Rho GTP結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槭Щ畹腉DP結(jié)合狀態(tài)，從而負(fù)性調(diào)節(jié)Rho GTP酶活性，由此參與黏著斑的形成和細(xì)胞骨架的重塑。黏著斑是細(xì)胞與胞外基質(zhì)的主要連接方式，是以整合素為中心的蛋白復(fù)合體，整合素的胞外段與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，整合素的胞內(nèi)段與肌動蛋白(actin)細(xì)胞骨架結(jié)合，從而介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)結(jié)合和信號胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與腫瘤細(xì)胞黏附、遷移、增殖、分化等過程。黏著斑的形成由Rho GTP酶家族蛋白調(diào)控，激活Rho促進(jìn)黏著斑的形成，抑制Rho則起到相反的作用。細(xì)胞骨架是與保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞運(yùn)動有關(guān)的纖維網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)細(xì)胞骨架或骨架相關(guān)蛋白發(fā)生突變或表達(dá)異常，便會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥和轉(zhuǎn)移。與actin相關(guān)的信號通路，如Rho GTP酶及下游效應(yīng)蛋白，均可通過細(xì)胞骨架，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。與微管相互作用的關(guān)鍵蛋白和細(xì)胞骨架actin之間的相互“交流”，在腫瘤轉(zhuǎn)移中受到越來越多的關(guān)注，可能為腫瘤轉(zhuǎn)移的治療提供新的思路[3]。研究表明，DLC2能夠通過其保守的RhoGAP結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)Rho GTP酶的活性，進(jìn)而抑制Rho蛋白調(diào)節(jié)的細(xì)胞骨架重塑和Ras誘導(dǎo)的小鼠成纖維細(xì)胞變形。

START結(jié)構(gòu)域位于C′末端，含有START結(jié)構(gòu)域的蛋白一般都命名為STARD(START domain contain)，因此，DLC1又名STARD12，DLC2又名STARD13，DLC3又名STARD8。START結(jié)構(gòu)域形成螺旋-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可容納疏水性脂質(zhì)，參與脂類轉(zhuǎn)運(yùn)、脂類代謝和代謝相關(guān)信號傳導(dǎo)。有文獻(xiàn)報(bào)道，DLC2可通過START結(jié)構(gòu)域，定位于線粒體和胞質(zhì)內(nèi)脂滴，提示其可能與脂質(zhì)參與的能量代謝有關(guān)[4]。另有報(bào)道，通過酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)DLC2與3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase)結(jié)合，提示DLC2可能參與脂質(zhì)合成代謝途徑。

此外，位于SAM結(jié)構(gòu)域和RhoGAP結(jié)構(gòu)域之間的318～472氨基酸序列是DLC2能定位于黏著斑必需的最小片段，該序列被命名為黏著斑定位(focal adhesion targeting, FAT)序列。因而，DLC蛋白亞家族也屬于黏著斑相關(guān)蛋白。

2 DLC2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

作為抑癌基因，DLC2在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失，如肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等。研究表明，其可通過調(diào)控細(xì)胞生長、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞脂類代謝及腫瘤血管生成等多個(gè)過程，抑制腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，并改善腫瘤耐藥性。本部分詳述其在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

2.1 DLC2在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用在肝癌細(xì)胞HepG2中，DLC2通過其RhoGAP活性，抑制Raf-1-ERK1/2-p70S6K通路，從而使肝癌細(xì)胞停滯于G1期，抑制肝癌細(xì)胞生長和遷移[5]。在HepG2細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)DLC2，細(xì)胞形態(tài)會變圓，并能明顯抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化，且RhoA活性明顯降低。肝癌臨床樣本中，DLC2低表達(dá)，且DLC2水平與肝癌病人總體生存期呈正相關(guān)。過表達(dá)DLC2，可抑制Rho GTP酶/RhoA/F-actin信號軸，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子YAP的轉(zhuǎn)錄激活功能，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞干性，并增強(qiáng)其對5-氟尿嘧啶敏感性[6]。

2.2 DLC2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用Neu轉(zhuǎn)基因小鼠中，如果同時(shí)敲除乳腺上皮中DLC2基因，可促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移[7]。miR-125b通過靶向抑制DLC2，促進(jìn)波形蛋白(vimentin)和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的轉(zhuǎn)移，miR-125b對α-SMA的調(diào)控作用可被ROCK抑制劑阻斷，表明miR-125b對α-SMA的調(diào)控是由DLC2/RhoA/ROCK通路介導(dǎo)的[8]。我們研究發(fā)現(xiàn)，DLC2基因在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的乳腺癌組織中表達(dá)較高，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的乳腺癌組織中表達(dá)較低，且DLC2表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)[9]。尚有研究表明，DLC2缺失可促進(jìn)基質(zhì)膠和腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成反應(yīng)，在內(nèi)皮細(xì)胞中沉默DLC2可削弱細(xì)胞黏附能力，促進(jìn)細(xì)胞遷移和小管形成，這些表型均可被RhoA沉默逆轉(zhuǎn)，表明DLC2對血管生成的調(diào)控是通過調(diào)節(jié)RhoA活性實(shí)現(xiàn)的[10]。三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MDA-MB-157中，miR-9通過部分靶向抑制STARD13，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞出芽和管腔結(jié)構(gòu)形成[11]。

2.3 DLC2在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用DLC2可通過其SAM結(jié)構(gòu)域與TAp73α相互作用，促進(jìn)TAp73α泛素化降解，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤發(fā)展，敲除DLC2的SAM結(jié)構(gòu)域，該作用被取消[12]。de Tayrac等[13]研究表明，抑癌基因DLC2低表達(dá)可促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤的侵襲，以及惡性膠質(zhì)瘤對依托泊苷的耐藥。另有研究表明，與正常組織相比，DLC2在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，但與Ⅰ級膠質(zhì)瘤相比，DLC2在Ⅳ級膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，即DLC2可抑制膠質(zhì)瘤增殖，但其對于膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移卻是必需的[14]。有研究表明，敲除DLC2可增強(qiáng)細(xì)胞邊緣RhoA活性，抑制Rac活性，增強(qiáng)黏著斑穩(wěn)定性和細(xì)胞黏附，抑制惡性膠質(zhì)瘤遷移[15]。DLC2在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過程中是否扮演著不同角色，甚至相反的角色，有待進(jìn)一步研究。

2.4 DLC2在其它腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用DLC2能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，但卻能促進(jìn)其遷移，與其在膠質(zhì)瘤中作用類似，因此，DLC2在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的不同作用有待深入研究[16]。Bera等[17]研究表明，miR-125b水平在耐吉西他濱的胰腺癌中異常增高，且miR-125b水平與DLC2呈負(fù)相關(guān)，提示DLC2可作為增強(qiáng)胰腺癌化療敏感性和抑制其轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)。

3 DLC2發(fā)揮作用的新機(jī)制——ceRNA

2011年7月由哈佛醫(yī)學(xué)院Pandolfi課題組首次提出[18]，認(rèn)為所有含有miRNA響應(yīng)原件的RNA轉(zhuǎn)錄體可通過競爭結(jié)合相同的miRNAs，進(jìn)行“交流”，并相互調(diào)控。ceRNA賦予了非編碼轉(zhuǎn)錄體新的功能，在轉(zhuǎn)錄體組形成了一個(gè)大規(guī)模的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，擴(kuò)大了人類基因組中的功能性遺傳信息。目前，對于ceRNA的研究，主要集中在腫瘤方向，并已證實(shí)其在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤等[19,20]。

近年來研究表明，DLC2可在轉(zhuǎn)錄后水平被調(diào)控，從而參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程(Fig 2)。本課題組前期研究表明，miR-125b可通過靶向于DLC2 3′-UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞骨架重構(gòu)，使其表型向間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移，但該作用可被ROCK抑制劑逆轉(zhuǎn)，表明miR-125b是通過DLC2/RhoA/ROCK信號通路發(fā)揮作用的，且在該研究中首次證實(shí)DLC2為miR-125b的靶基因[8]。進(jìn)一步研究表明，DLC2通過其3′-UTR區(qū)4546-4560 nt處的miR-125b結(jié)合位點(diǎn)，抑制miR-125b的活性，進(jìn)而促進(jìn)TP53INP1及其下游信號分子SPARC和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/9的表達(dá)，即DLC2通過扮演TP53INP1的ceRNA，抑制乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移[21]。DLC2 3′-UTR還可通過扮演抑凋亡蛋白BMF的ceRNA，促進(jìn)BMF的表達(dá)，增強(qiáng)BMF與Bcl-2結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的釋放，發(fā)揮促乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用[22]。課題組研究表明，DLC2、CDH5、HOXD1、HOXD10之間通過ceRNA機(jī)制調(diào)控彼此表達(dá)水平，從而抑制乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移，并將該ceRNA網(wǎng)絡(luò)簡稱為DLC2相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)[9]。最近研究證實(shí)，DLC2相關(guān)ceRNA還可通過扮演Hippo通路中關(guān)鍵激酶LATS1/2的“子ceRNA網(wǎng)絡(luò)”，促進(jìn)LATS1/2的表達(dá)，進(jìn)而激活Hippo通路，促進(jìn)下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子YAP/TAZ核質(zhì)轉(zhuǎn)位，削弱YAP/TAZ的轉(zhuǎn)錄活性；同時(shí)該ceRNA網(wǎng)絡(luò)還可通過DLC2的RhoGAP活性，抑制RhoA/ROCK1/MLC/F-actin信號通路，促進(jìn)YAP/TAZ的核質(zhì)轉(zhuǎn)位，進(jìn)而抑制YAP/TAZ的轉(zhuǎn)錄活性。通過以上兩條信號通路，DLC2相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)可抑制乳腺癌細(xì)胞的干性。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，DLC2及其ceRNA在耐阿霉素的乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，過表達(dá)DLC2相關(guān)ceRNA可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性，且該活性是依賴于miRNAs的[23]。另外，DLC2還可扮演促凋亡蛋白Fas的ceRNA，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡[24]。

Fig 1 Protein domains of DLC2: SAM domain,RhoGAP domain, START domain, and FAT sequences

Fig 2 DLC2 involved in tumorigenesis and progression via ceRNA mechanism

對于DLC2被調(diào)控的機(jī)制，課題組進(jìn)一步證實(shí)，趨化因子受體CCR2的3′-UTR還可以通過扮演DLC2的ceRNA促進(jìn)DLC2的表達(dá)，并通過其抑制RhoA/ROCK1通路，發(fā)揮抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的功能，且該功能與CCR2蛋白本身的功能相反，這也進(jìn)一步證實(shí)了mRNA的3′-UTR可能發(fā)揮與mRNA本身編碼的蛋白功能相反的功能[25]。但在我們的研究中，DLC2的3′-UTR功能與DLC2 mRNA編碼的蛋白本身功能相一致。另外，課題組成員Zheng等[26]研究還發(fā)現(xiàn)，DLC2的表達(dá)還受到RNA結(jié)合蛋白RNPC1的調(diào)控，RNPC1可通過結(jié)合DLC2相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的CDH5和HOXD10的3′-UTR，增強(qiáng)它們的mRNA穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)它們的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)DLC2及該ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的另外一個(gè)成員HOXD1的表達(dá)，最終發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞遷移的作用。Zhou等[27]通過染色質(zhì)免疫共沉淀及熒光素酶報(bào)告法研究發(fā)現(xiàn)，HOXB4(Homeobox B4)可直接作用于DLC2的啟動子，從而增強(qiáng)DLC2的轉(zhuǎn)錄活性及其表達(dá)，通過抑制RhoA/ROCK1通路，抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移，并增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對化療藥物阿霉素的敏感性。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，DLC2主要通過其保守的RhoGAP及SAM結(jié)構(gòu)域發(fā)揮抑癌作用，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞脂類代謝及腫瘤血管生成等多個(gè)過程，從而抑制腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移。另外，作為miRNAs靶標(biāo)，DLC2可在轉(zhuǎn)錄后水平被調(diào)控，并通過ceRNA機(jī)制與其他基因相互調(diào)控，參與調(diào)控腫瘤的凋亡、轉(zhuǎn)移、干性、耐藥性等，進(jìn)一步擴(kuò)大了DLC2的功能。未來研究應(yīng)進(jìn)一步剖析DLC2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制及其被調(diào)控機(jī)制，挖掘促進(jìn)DLC2表達(dá)的藥物，作為協(xié)同化療的輔助治療手段。此外，DLC2的抗腫瘤作用及其在腫瘤中的低表達(dá)賦予它作為腫瘤生物標(biāo)志物的新角色，可為臨床進(jìn)行基因診斷和治療及預(yù)后監(jiān)測提供新的思路。