史榮華 周揚(yáng) 李一民 張建軍 任丹 高巍

摘要? ? 2018年11月，江蘇省某肉種雞場(chǎng)26周齡雞群出現(xiàn)采食下降、精神沉郁、消瘦、產(chǎn)蛋下降、死亡等癥狀，臨床剖檢主要病變?yōu)楦闻K、脾臟腫大，表面可見(jiàn)灰白色結(jié)節(jié)，腺胃、腎臟腫大，胸骨上可見(jiàn)圓形白色腫瘤病灶。為了明確肉種雞發(fā)病的原因及確定病原，無(wú)菌采取肝臟、腎臟等病變組織，開(kāi)展了PCR鑒定和組織病理學(xué)觀察等實(shí)驗(yàn)室診斷。結(jié)果表明，病料PCR檢測(cè)禽白血病毒和馬立克氏病毒為陽(yáng)性，組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟、腺胃、心肌內(nèi)彌漫大量MD和ALV-J特有腫瘤細(xì)胞。上述結(jié)果初步表明，該病例為J亞群禽白血病病毒與馬立克氏病病毒混合感染。

關(guān)鍵詞? ? 肉種雞;禽白血病;馬立克氏病;混合感染;診斷

中圖分類(lèi)號(hào)? ? S858.31? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A? ? ? ? 文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）09-0199-03

禽白血病（AL）是由禽白血病病毒（ALV）感染引起的免疫抑制性疾病以及各種可傳播的良性和惡性腫瘤[1]。ALV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬，分為A～K 11個(gè)不同亞群，其中A、B、C、D、E、J、K 7個(gè)亞群可自然感染雞[2]，J亞群禽白血病病毒的致病力和感染性較強(qiáng)[3]，可引起肉雞、蛋雞、種雞髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞增生的一種腫瘤性疾病，在世界范圍內(nèi)廣泛存在，目前臨床上多見(jiàn)骨髓細(xì)胞瘤或血管瘤與骨髓細(xì)胞瘤混合發(fā)生的病例[4]。雞馬立克氏?。∕D）是由馬立克氏病病毒（MDV）引起的淋巴組織增生和淋巴腫瘤的一種疾病[5]。MDV屬于皰疹病毒科一種α皰疹病毒，這種病毒具有高度的傳染性，常以外周神經(jīng)和其他各種組織器官的單核細(xì)胞浸潤(rùn)形成腫瘤為特征。根據(jù)病毒株抗原性差異分為3個(gè)血清型，并且2～18周齡的雞均可感染發(fā)病，是危害養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病。禽白血?。ˋL）和馬立克氏?。∕D）是家禽常見(jiàn)的2種病毒性腫瘤病，可水平傳播、垂直傳播，不僅使感染雞群的生產(chǎn)性能下降，而且容易引起免疫抑制，增加對(duì)其他疾病的易感性，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。2018 年11月江蘇某肉種雞場(chǎng)發(fā)生疑似腫瘤病的雞群，經(jīng)臨床剖檢及實(shí)驗(yàn)室鑒定為J亞群禽白血病病毒與馬立克氏病病毒混合感染。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 病料信息

病料來(lái)源于江蘇省某肉種雞場(chǎng)，26周齡黃羽肉種雞，剖檢疑似腫瘤病癥狀，無(wú)菌采集具有典型病變的肝、脾、腎等病料組織用于PCR鑒定以及組織病理學(xué)觀察。

1.2? ? 試驗(yàn)材料

DNA提取純化試劑盒、2×Easy TaqSuperMix、普通瓊脂糖凝膠、DL2000 DNA Marker，根據(jù)參照文獻(xiàn)[7-8]設(shè)計(jì)了MDV、REV、ALV的鑒定引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，見(jiàn)表1。

1.3? ? PCR檢測(cè)

采集病雞腫瘤病變組織，按1∶5加入含適當(dāng)濃度抗生素的滅菌PBS緩沖液，充分研磨，反復(fù)凍融3次后，離心取上清[2]，用DNA提取試劑盒抽提組織液中的DNA，置-20 ℃?zhèn)溆?。以提取的病毒DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，2×Easy TaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳處理后置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照鑒定。

1.4? ? 病理組織學(xué)檢測(cè)

用福爾馬林固定病變組織（如肝臟、脾臟等），按文獻(xiàn)[9]制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，進(jìn)行組織病理學(xué)診斷。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 病雞剖檢癥狀

現(xiàn)場(chǎng)剖檢發(fā)現(xiàn)，病死雞主要表現(xiàn)為肝臟腫大，表面彌漫性灰白色腫瘤結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖1（a）（b）;脾臟腫大，有彌漫性灰白色腫瘤結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖1（c）（d）;胸骨內(nèi)外側(cè)有圓形白色腫瘤病灶，見(jiàn)圖1（e）（f）;腸道表面白色腫瘤結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖1（g）;腎臟腫大，表面彌漫性白色腫瘤結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖1（h）。

2.2? ? PCR鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)REV-LTR引物未擴(kuò)增出目的條帶，MDV-meq擴(kuò)增出目的條帶，大小約為1 058 bp，ALV-P27擴(kuò)增出目的條帶，大小約348 bp（圖2）。該病料PCR檢測(cè)REV為陰性，MDV和ALV為陽(yáng)性。

2.3? ? 組織病理學(xué)檢測(cè)

組織病理學(xué)顯示：肝內(nèi)多個(gè)腫瘤病灶，肝內(nèi)腫瘤細(xì)胞為MD特有的腫瘤細(xì)胞，見(jiàn)圖3（a）（b）;心肌內(nèi)大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌內(nèi)腫瘤細(xì)胞為MD特有腫瘤細(xì)胞，見(jiàn)圖3（c）（d）;腺胃內(nèi)大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn) 腺胃內(nèi)腫瘤細(xì)胞為MD特有腫瘤細(xì)胞，見(jiàn)圖3（e）（f）;脾臟1內(nèi)大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，脾臟1內(nèi)腫瘤細(xì)胞為ALV-J特有腫瘤細(xì)胞，見(jiàn)圖3（g）（h）;脾臟2內(nèi)大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，脾臟2內(nèi)腫瘤細(xì)胞為MD特有腫瘤細(xì)胞，見(jiàn)圖3（j）（k）。

3? ? 討論

禽白血病和馬立克氏病是2種病原（分別屬于RNA病毒和DNA病毒）完全不同的疾病，并且都以類(lèi)似的肉眼可見(jiàn)腫瘤病變?yōu)樘卣鱗10]。隨著規(guī)模化養(yǎng)殖的擴(kuò)大，家禽疫病已經(jīng)變得日益復(fù)雜，混合感染已經(jīng)成為腫瘤病毒、免疫抑制性病毒感染的主要方式，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[11]。造成ALV和MDV混合感染的主要原因可能有以下幾種：①ALV既可以垂直傳播，又可以水平傳播，祖代雞場(chǎng)白血病凈化不徹底，通過(guò)種雞垂直傳染給下一代，從而引起雛雞產(chǎn)生免疫抑制，免疫應(yīng)答下降，即使雛雞接種MDV疫苗，仍會(huì)感染MDV野毒而發(fā)病;②除自然傳播方式外，接種了被外源性ALV污染的弱毒活疫苗，也會(huì)引起ALV的感染;③雛雞在免疫M(jìn)DV疫苗時(shí)，免疫過(guò)程出現(xiàn)了問(wèn)題，則會(huì)導(dǎo)致免疫效果降低或者免疫失敗，使雞群感染MDV野毒引起機(jī)體免疫抑制，最終通過(guò)水平傳播感染ALV[5];④養(yǎng)殖環(huán)境生物安全方面的缺失、飼養(yǎng)環(huán)境惡劣、粗放的飼養(yǎng)管理等也會(huì)促進(jìn)病原的擴(kuò)散與傳播[11]。

本試驗(yàn)從江蘇省某肉種雞場(chǎng)采集病料，根據(jù)臨床解剖病變，PCR擴(kuò)增及病理組織學(xué)分析，最終初步診斷該病例為J亞群禽白血病病毒與馬立克氏病病毒混合感染。J亞群禽白血病腫瘤的原發(fā)部位在骨髓，骨膜下可見(jiàn)白色石灰樣增生的腫瘤組織，隆起于骨表面[12]。對(duì)于此種混合感染的情況，目前主要實(shí)行凈化種群為主的綜合性防制措施[10]。注射疫苗是預(yù)防MD的有效方法，從CVI988/Rispens、814株單苗到cVI988/

Ripense+HVI二聯(lián)疫苗，每類(lèi)疫苗能在一段時(shí)期內(nèi)有效控制其發(fā)生[11];對(duì)于AL，目前還沒(méi)有有效的疫苗，更沒(méi)有有效的藥物可以治療。因此，比較好的辦法就是加強(qiáng)凈化淘汰，自行清除ALV—J陽(yáng)性的雞群或者引進(jìn)國(guó)外雞群時(shí)加強(qiáng)ALV—J篩查，最后逐步建立無(wú)ALV—J感染的雞群，改善飼養(yǎng)環(huán)境[13]。同時(shí)，還應(yīng)加強(qiáng)種雞的飼養(yǎng)管理和嚴(yán)格的生物安全措施，以減少水平傳播，并選擇無(wú)外源病毒污染的疫苗進(jìn)行合理免疫，避免因疫苗污染而導(dǎo)致雞群感染禽白血病[14]。本試驗(yàn)診斷為該雞場(chǎng)下一步的預(yù)防和凈化工作起到一定的參考作用。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介? ?史榮華（1987-），男，江蘇泰州人，碩士，從事病毒免疫學(xué)研究工作。

收稿日期? ?2019-01-08