古輝， 徐小彭， 黃國華， 李雪平， 陳少立

佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科(廣東佛山 528500)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見的以逐漸進展和持續(xù)的氣流受限為特征的肺部疾病[1]。吸煙是COPD的危險因素，COPD患者在污染的空氣刺激下易導(dǎo)致肺部炎癥，導(dǎo)致小氣道阻塞和肺氣腫[2]。同時COPD肺部持續(xù)著慢性炎癥，并存在不同程度的氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]。目前對于COPD主要的治療仍集中在控制癥狀，仍缺乏有效針對改善疾病的治療方案。氣道上皮細胞是抵抗進入呼吸道的有害病原體和刺激物的第一道防線。除了保持物理屏障外[4]，它們還通過分泌保護性蛋白質(zhì)來形成化學(xué)屏障，例如分別含有殺菌/增加滲透性的褶皺家族成員BPIFA1(BPI Fold Containing Family A Member 1)和BPIFB1(BPI Fold Containing Family B Member 1)[5]。BPIF家族的所有成員均具有殺菌/通透性增加蛋白(BPI)的三維結(jié)構(gòu)。BPIFA蛋白具有單個的BPIF結(jié)構(gòu)域從而發(fā)揮功能[6]。BPIFA1定位于呼吸道上皮和上呼吸道的黏膜下腺。且BPIFA1不存在于健康肺的肺泡區(qū)域，該蛋白在健康氣道中表達水平很少[7]。且BPIFA1蛋白質(zhì)的表達和分泌均依賴于上皮細胞群的分化狀態(tài)。目前BPIFA1與COPD的關(guān)系仍有待進一步闡明。既往研究[8]顯示，小樣本的COPD人群研究顯示COPD患者的氣道上皮和痰液中的BPIFA1水平與非COPD患者相比增加。但其與病情分度及肺部功能的關(guān)系仍需要進一步明確。本研究旨在探討COPD患者誘導(dǎo)痰BPIFA1的表達水平與病情的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年9月至2018年2月我院進行診治的COPD患者共126例。納入標準：(1)符合《慢性阻塞性肺疾病指南》[9]的診斷標準；(2)COPD分期為穩(wěn)定期和急性加重期(AECOPD)；(3)年齡50～80歲；(4)獲得患者及家屬同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并嚴重心、肝、腎功能不全患者；(2)合并肺部惡性腫瘤；(3)合并支氣管擴張、肺結(jié)核和哮喘；(4)近3個月出現(xiàn)心肌梗死的患者；(5)近2周內(nèi)采用糖片質(zhì)激素治療；(6)重度營養(yǎng)不良或電解質(zhì)紊亂的患者。選取年齡相仿的40例肺功能健康體檢者作為對照組，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核并批準。126例患者年齡53～78歲，其中COPD穩(wěn)定期的81例，AECOPD 45例，GOLD分級Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級分別為75、39、12例。兩組患者的一般資料對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 肺功能檢測 入院后采用Medgraphics Elite肺功能檢測系統(tǒng)對所有COPD患者進行肺功能檢測，采用GOLD分級系統(tǒng)對肺功能進行分級。

項目COPD組(n=126)對照組(n=40)t/2值P值年齡(歲)65.4±8.262.3±11.41.8850.061性別(例)1.3000.254 男6926 女5714體質(zhì)指數(shù)(kg/m2)22.7±1.823.2±2.11.4690.144高血壓[例(%)]78(61.9)22(55.0)0.6040.437糖尿病[例(%)]32(25.4)11(27.5)0.0700.791冠心病[例(%)]23(18.3)4(10.0)1.5190.218吸煙史[例(%)]59(46.8)13(32.5)2.5370.111

1.2.2 誘導(dǎo)痰檢測 COPD患者和健康受試者在3%高滲鹽水進行霧化吸入15 min后，清潔口腔及鼻腔的分泌物后，再用力咳嗽咳出約1 g痰液到培養(yǎng)皿，并以4倍體積的0.1%DTT溶液在37℃下進行消化后，加入等體積的PBS溶液后進行篩網(wǎng)過濾，過濾液在3 000 r/min離心后固定采用HE染色，光鏡下對細胞進行分類計數(shù)，記錄患者的中性粒細胞比例。

1.2.3 BPIFA1檢測 將誘導(dǎo)痰在4℃下進行離心后，取上清置于-20℃下進行保存。BPIFA1采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)進行檢測，試劑盒購自LifeSpan BioSciences(LS-F8634-1)，具體檢測步驟按照試劑盒說明嚴格進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK法檢驗；計數(shù)資料采用百分比表示，比較采用2檢驗，相關(guān)性檢驗采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD患者肺功能情況及兩組誘導(dǎo)痰指標比較 COPD組平均入院時的FEV1/FVC為(53.5±8.7)%，COPD組患者的中性粒細胞比例及BPIFA1含量均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表2。

項目例數(shù)中性粒細胞比例(%)BPIFA1(ng/mL)COPD組12667.4±8.35.2±1.8對照組4041.5±7.13.3±0.6t值17.7706.550P值<0.001<0.001

2.2 COPD不同分期及分級誘導(dǎo)痰BPIFA1表達水平對比 穩(wěn)定期的誘導(dǎo)痰BPIFA1含量為(4.50±1.61)ng/mL，AECOPD的含量水平為(6.33±1.47) ng/mL，AECOPD的BPIFA1含量水平顯著高于穩(wěn)定期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.61,P<0.001)。GOLD分級為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級的誘導(dǎo)痰BPIFA1含量分別為(4.57±1.64)、(5.66±1.46)、(7.13±1.87) ng/mL，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.02,P<0.001)。且GOLD分級Ⅳ級的BPIFA1含量水平顯著高于Ⅱ級和Ⅲ級，GOLD分級Ⅲ級BPIFA1含量顯著高于Ⅱ級，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

*P<0.001, △P<0.05

2.3 COPD患者誘導(dǎo)痰BPIFA1含量與肺功能的關(guān)系 對126例COPD患者誘導(dǎo)痰BPIFA1含量與FEV1/FVC進行相關(guān)性分析，誘導(dǎo)痰中BPIFA1含量與FEV1/FVC呈顯著的負相關(guān)(r=-0.503,P<0.001)，見圖2。

圖2 誘導(dǎo)痰BPIFA1含量與FEV1/FVC的相關(guān)性分析

2.4 COPD患者誘導(dǎo)痰BPIFA1含量與中性粒細胞的關(guān)系 COPD患者誘導(dǎo)痰中的BPIFA1含量與中性粒細胞比例呈顯著的正相關(guān)(r=0.447,P<0.001)，見圖3。

圖3 誘導(dǎo)痰BPIFA1含量與中性粒細胞比例的相關(guān)性分析

3 討論

在本研究中，通過分析COPD患者誘導(dǎo)痰樣本中的BPIFA1表達水平，明確了BPIFA1在COPD患者中誘導(dǎo)痰中的含量顯著高于健康人群。此外，本研究進一步分析了不同分期及不同分級中的誘導(dǎo)痰中BPIFA1水平，并明確了AECOPD和GOLD高分級的患者其誘導(dǎo)痰中BPIFA1水平顯著增高。且誘導(dǎo)痰中BPIFA1水平與肺功能呈顯著的負相關(guān)，與誘導(dǎo)痰中的中性粒細胞比例顯著呈正相關(guān)，表明了BPIFA1在COPD的病情進展中發(fā)揮了重要的作用。

BPIFA1在上呼吸道和鼻咽區(qū)特異性表達，有研究[10]表明在COPD患者痰標本中的氣道上皮中發(fā)現(xiàn)BPIFA1高表達。進一步研究[11]顯示吸煙者支氣管灌洗液中BPIFA1水平呈降低的趨勢。且BPIFA1蛋白表現(xiàn)出對革蘭陰性細菌的抗菌活性。因此，BPIFA1在上呼吸道刺激引起的炎癥反應(yīng)中具有重要的作用。BPIFA1是氣道保護中的重要參與者，目前證據(jù)[12]顯示其發(fā)揮保護作用的主要是通過發(fā)揮其抗菌作用介導(dǎo)。此外，BPIFA1在離子轉(zhuǎn)運和氣道表面液體調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用[13]。BPIFA1可作為上皮鈉通道(ENaC)的負調(diào)節(jié)因子，并潛在以這種機制影響氣道表面液體高度。同時，BPIFA1可增強ENaC活性引起的異常黏液流變學(xué)導(dǎo)致氣道阻塞和黏液停滯，這反過來可能導(dǎo)致細菌感染并隨后增加COPD患者的炎癥[14-15]。因此，這可能是BPIFA1與肺功能呈顯著負相關(guān)的重要原因。

研究[16]表明，BPIFA1在氣道上皮內(nèi)表達具有保護上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)的功能。而COPD患者的BPIFA1水平顯著升高，這可能是BPIFA1在COPD患者出現(xiàn)炎癥后氣道通過反饋分泌增多發(fā)揮保護功能。研究顯示肺部組織在炎癥和感染的急性癥狀中上皮細胞儲存的BPIFA1蛋白質(zhì)快速釋放，導(dǎo)致誘導(dǎo)痰中的BPIFA1 表達顯著增高[17]。此外，在COPD特別是急性期中，誘導(dǎo)痰中性粒細胞比例顯著增高，中性粒細胞彈性蛋白酶以劑量依賴的方式降解BPIFA1[18]。因此，在COPD患者中分泌BPIFA1增加的情況下，其也需要肺部滲出更多的中性粒細胞對誘導(dǎo)痰中的BPIFA1進行降解，因此本研究結(jié)果也顯示了誘導(dǎo)痰中BPIFA1與中性粒細胞比例呈正相關(guān)。然而，BPIFA1在COPD患者中具體對肺功能影響的機制仍需要進一步深入研究。

綜上所述，COPD患者誘導(dǎo)痰樣本中的BPIFA1表達水平顯著增高，且與病情分期及分級相關(guān)，誘導(dǎo)痰BPIFA1表達水平與肺功能呈顯著的負相關(guān)，與中性粒細胞比例呈顯著的正相關(guān)。