李寧寧， 唐毅， 黎璞， 熊之璋， 黃雋， 蘇榕△

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1乳腺外科， 2婦科(廣東廣州 510150)

乳腺癌是中國(guó)女性發(fā)病率居首位的惡性腫瘤，2014年新增病例27.89萬(wàn)例[1]，發(fā)病年齡比西方國(guó)家提前10年以上，其中確診時(shí)年齡<50歲者超過(guò)50%，這意味著許多患者還未生育，并希望在診斷乳腺癌后妊娠、分娩，而世界范圍內(nèi)新增乳腺癌患者僅25%未絕經(jīng)[2]?；熥鳛槿橄侔┑闹饕委煼椒蓪?dǎo)致卵巢功能衰竭[2]，早期乳腺癌5年生存率80%～90%[3]，盡管這些患者長(zhǎng)期生存，但面臨不孕的巨大風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響年輕乳腺癌患者，特別是未生育患者的生活質(zhì)量。目前證據(jù)尚未發(fā)現(xiàn)乳腺癌幸存者生育會(huì)造成復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加，也未發(fā)現(xiàn)出生嬰兒缺陷率增加，近年育齡期乳腺癌患者生育功能保護(hù)問(wèn)題也日益引起重視[4-5]。抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)是一項(xiàng)反映女性卵巢儲(chǔ)備功能(ovarian reserve，OR)靈敏準(zhǔn)確的血清學(xué)指標(biāo)，可反映卵巢原始卵泡池大小，在月經(jīng)周期中保持較恒定的水平[6]。使用AMH評(píng)估乳腺癌患者卵巢儲(chǔ)備功能的研究在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)絕經(jīng)前乳腺癌患者化療期間及隨訪期內(nèi)AMH及常規(guī)指標(biāo)雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，記錄化療誘導(dǎo)閉經(jīng)(chemotherapy-induced amenorrhea，CIA)及月經(jīng)恢復(fù)情況，探討CIA及化療后殘存卵巢儲(chǔ)備功能的預(yù)測(cè)指標(biāo)，為早期識(shí)別卵巢儲(chǔ)備功能降低的育齡期乳腺癌患者提供依據(jù)，便于其及時(shí)獲得生育咨詢(xún)。

1 資料與方法

1.1 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 2016年2月至2017年9月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院乳腺外科收治的乳腺癌患者，納入符合以下所有條件者：(1)原發(fā)性可切除無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者；(2)入組前有規(guī)律月經(jīng)至少3個(gè)周期；(3)擬行化療方案包含環(huán)磷酰胺。如符合以下任一項(xiàng)條件予排除：(1)既往或治療過(guò)程中行子宮切或卵巢切除術(shù)； (2)既往或治療過(guò)程中患卵巢腫瘤；(3)既往接受化療；(4)入組前30 d內(nèi)使用過(guò)性激素避孕藥；(5)妊娠期；(6)使用促性腺激素釋激素類(lèi)似物。研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法 本研究為前瞻性隊(duì)列研究，記錄患者年齡、體質(zhì)指數(shù)、治療前后月經(jīng)狀態(tài)、病理結(jié)果及化療方案。CIA定義為化療后停經(jīng)至少持續(xù)6個(gè)月。月經(jīng)恢復(fù)的定義為：出現(xiàn)CIA的患者在化療結(jié)束后隨訪期內(nèi)恢復(fù)規(guī)律陰道出血。分別于化療前、化療1周期后及化療結(jié)束后3周內(nèi)及化療完成后6月共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)入組患者血清激素水平。血清AMH水平采用酶聯(lián)免疫法，AMH定量檢測(cè)試劑盒(KR-AMH-001，康潤(rùn)生物科有限公司，廣州)， 最低檢測(cè)限量為0.06 ng/mL，室內(nèi)質(zhì)控變異系數(shù)3%～5%。血清FSH檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法(CMIA)，F(xiàn)SH測(cè)定試劑盒(7K75 Abbott Ireland Diagnostics Division)，最低檢測(cè)限量為0.05 IU/L，室內(nèi)質(zhì)控變異系數(shù)<5%。血清E2檢測(cè)采用CMIA法，E2測(cè)定試劑盒(7K72，Abbott Ireland Diagnostics Division)最低檢測(cè)限量為10 pg/mL，室內(nèi)質(zhì)控變異系數(shù)<7%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，重復(fù)測(cè)量計(jì)量資料采用方差分析，不符合正態(tài)分布、方差齊性或存在異常值時(shí)使用非參數(shù)檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共納入40例絕經(jīng)前乳腺癌患者，化療前年齡26～50歲，平均(41.60±6.59)歲，體質(zhì)指數(shù)15.6～27.1 kg/m2，平均(22.78±2.98)kg/m2，33例ER/PR陽(yáng)性并接受他莫昔芬治療，7例ER/PR均陰性。15例HER-2 陽(yáng)性患者中用12例使用曲妥珠單抗?；煼桨赴?(1)EC-D(累計(jì)環(huán)磷酰胺2 000 mg/m2、表阿霉素360 mg/m2、多西他賽320 mg/m2)；(2)ddEC-P(累計(jì)環(huán)磷酰胺2 000 mg/m2、表阿霉素360 mg/m2、紫杉醇700 mg/m2)；(3)EC-wP(累計(jì)環(huán)磷酰胺2 000 mg/m2、表阿霉素360 mg/m2、紫杉醇960 mg/m2)；(4)TEC(累計(jì)環(huán)磷酰胺3 000 mg/m2、表阿霉素540 mg/m2、多西他賽450 mg/m2)；(5)TC(累計(jì)環(huán)磷酰胺2 000～3 000 mg/m2、多西他賽300～450 mg/m2)。見(jiàn)表1。所有患者隨訪至化療結(jié)束后至少6個(gè)月。

表1 絕經(jīng)前乳腺癌患者臨床特征

2.2 卵巢儲(chǔ)備功能

2.2.1 AMH 化療前基線AMH水平與年齡呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表2。經(jīng)過(guò)1周期化療AMH明顯下降(P=0.000)，并隨化療的進(jìn)行持續(xù)降低；至化療結(jié)束時(shí)基本低于檢測(cè)下限；化療結(jié)束6個(gè)月后，AMH水平雖然有所回升，但與化療結(jié)束時(shí)無(wú)明顯差異(P=0.862)，仍明顯低于化療前(P=0.000)，見(jiàn)表3?；熃Y(jié)束6個(gè)月時(shí)，AMH水平與入組年齡及基線E2均呈負(fù)相關(guān)(P=0.000，P=0.002)，而與基線AMH呈正相關(guān) (P=0.007),見(jiàn)表4?；€AMH較高的患者，其化療1周期后(Rs=0.669，P=0.000)及化療結(jié)束時(shí)的AMH水平仍較高(Rs=0.351，P=0.026)。

2.2.2 E2化療前基線E2水平與入組年齡呈正相關(guān)，見(jiàn)表2，化療1周期后較基線升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.829)；至化療結(jié)束后，E2明顯降低(P=0.000)，處于絕經(jīng)后范圍內(nèi)(<90 pmol/L)；化療結(jié)束6個(gè)月時(shí)，E2與化療后無(wú)明顯差異(P=0.109)，見(jiàn)表3?；颊呷虢M年齡越小(P=0.020)，基線AMH越高(P=0.015)，化療結(jié)束6個(gè)月時(shí)E2水平相對(duì)更高，見(jiàn)表4。

表2 化療前卵巢儲(chǔ)備功能相關(guān)因素

表3化療前后及隨訪期卵巢儲(chǔ)備功能變化

項(xiàng)目化療前(n=40)化療1周期(n=40)化療結(jié)束時(shí)(n=40)化療結(jié)束6個(gè)月(n=40)距化療開(kāi)始時(shí)間-2～3周2～5月8～12月AMH (ng/mL)2.38±0.721.10±0.44?0.08±0.01?0.51±0.27?E2 (pmol/L)408.67±50.13502.70±90.5153.55±7.02?163.65±52.08?FSH (IU/L)7.25±1.8016.33±3.0757.03±3.75?32.97±2.70? △

*與化療前比較P<0.01; △與化療結(jié)束時(shí)比較P<0.01

2.2.3 FSH 單次化療對(duì)患者FSH的影響與基線相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.119)，但此時(shí)FSH平均值已>10 IU/L，至6～8周期化療結(jié)束時(shí)，F(xiàn)SH明顯高于基線水平(P=0.000)，且FSH達(dá)到絕經(jīng)后范圍(>22 IU/L)；化療結(jié)束6個(gè)月后FSH與化療結(jié)束時(shí)相比明顯回落(P=0.001)，但仍基本位于絕經(jīng)后范圍內(nèi)，見(jiàn)表3。未發(fā)現(xiàn)化療結(jié)束6個(gè)月時(shí)FSH的相關(guān)因素，見(jiàn)表4。

2.3 CIA及月經(jīng)恢復(fù) 共有38例患者出現(xiàn)CIA，占95%，隨訪至化療結(jié)束6個(gè)月時(shí)，即距開(kāi)始化療8～12個(gè)月，此時(shí)CIA患者中有13.2%(5/38)恢復(fù)規(guī)律月經(jīng)，因此月經(jīng)規(guī)律的患者共占17.5%(7/40)。出現(xiàn)CIA主要和入組年齡較大(P=0.045)和化療前AMH水平較低相關(guān)(P=0.023)，而入組年齡較小(P=0.008)及化療前AMH水平較高(P=0.003)的患者更容易恢復(fù)規(guī)律月經(jīng)，見(jiàn)表5。本研究未發(fā)現(xiàn)化療方案與CIA及月經(jīng)恢復(fù)有明顯相關(guān)性。

表4 化療結(jié)束6個(gè)月后卵巢功能相關(guān)因素

表5 CIA及月經(jīng)恢復(fù)相關(guān)因素

3 討論

本研究是一項(xiàng)單中心前瞻性研究，主要探討包含環(huán)磷酰胺的化療方案對(duì)絕經(jīng)前乳腺癌患者卵巢儲(chǔ)備功能的影響及其相關(guān)因素，探討CIA及化療后殘存卵巢儲(chǔ)備功能的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

卵巢儲(chǔ)備功能由原始卵泡決定，而原始卵泡數(shù)自出生后不再增加，至青春期后的每個(gè)月經(jīng)周期里，原始卵泡以大致固定比例被招募，并開(kāi)始生長(zhǎng)發(fā)育，通常只有一個(gè)卵泡發(fā)育成熟并排卵，其余招募卵泡閉鎖。因此，隨著女性年齡的增加，原始卵泡進(jìn)行性減少，卵巢儲(chǔ)備功能逐年降低。當(dāng)年齡超過(guò)35～37歲預(yù)示卵巢儲(chǔ)備下降，超過(guò)40歲是公認(rèn)的卵巢低反應(yīng)高危因素[7]。原始卵泡數(shù)目前尚無(wú)法直接測(cè)量。不過(guò)，一旦原始卵泡被招募就開(kāi)始分泌AMH，當(dāng)卵泡增長(zhǎng)超過(guò)8 mm進(jìn)入FSH依賴(lài)生長(zhǎng)階段時(shí)AMH停止分泌，因此AMH可間接反映原始卵泡數(shù)，絕經(jīng)后AMH不能測(cè)及[8]。較低的AMH閾值對(duì)判斷卵巢儲(chǔ)備功能不良有良好的敏感性和特異性，此外，AMH還參與調(diào)節(jié)原始卵泡招募，降低原始卵泡對(duì)FSH的敏感性，避免原始卵泡過(guò)度損耗[9]。對(duì)年齡20～40歲女性，目前認(rèn)為AMH位于1.0～3.0 ng/mL為卵巢儲(chǔ)備功能正常水平，0.7～0.9 ng/mL為偏低，0.3～0.6 ng/mL為降低，<0.3 ng/mL極低[8]。

E2主要由生長(zhǎng)期卵泡分泌，隨著卵泡的生長(zhǎng)，E2逐漸升高。而當(dāng)卵巢內(nèi)儲(chǔ)備的卵泡減少，不能產(chǎn)生足夠的抑制素來(lái)抑制FSH時(shí)，更多的FSH可促使原始卵泡提前進(jìn)入募集和生長(zhǎng)階段，導(dǎo)致后一月經(jīng)周期的卵泡早期已存在提前發(fā)育的卵泡，并產(chǎn)生較高水平的E2。因此，基礎(chǔ)E2升高提示卵巢儲(chǔ)備功能降低，而且其升高早于基礎(chǔ)FSH的升高[7,9]。

FSH由垂體前葉分泌，能刺激生長(zhǎng)期卵泡顆粒細(xì)胞增生分化，并刺激卵泡產(chǎn)生雌激素[8]?；A(chǔ)FSH水平可間接反映卵泡池的大小，F(xiàn)SH超過(guò)10 IU/L對(duì)判斷卵巢儲(chǔ)備功能降低有很高的特異性，但敏感性不高[7]。FSH正常而基礎(chǔ)E2升高，是介于卵巢儲(chǔ)備功能明顯降低和正常之間的過(guò)渡階段。如果基礎(chǔ)FSH和E2水平均升高，則提示卵巢儲(chǔ)備降低?；A(chǔ)血清E2在184～367 pmol/L范圍內(nèi)預(yù)測(cè)卵巢低反應(yīng)，但應(yīng)與FSH結(jié)合判斷[7]。

本研究中化療前基線AMH為(2.38±0.72)ng/mL， FSH均值未超過(guò)10 IU/L，提示入組患者卵巢儲(chǔ)備功能位于正常范圍內(nèi)，其中年齡較大者AMH偏低而E2偏高。經(jīng)過(guò)1周期化療，AMH明顯下降，E2濃度較基線有升高的趨勢(shì)，F(xiàn)SH平均值>10 IU/L，說(shuō)明含有環(huán)磷酰胺的方案僅單次給予就可損傷卵巢儲(chǔ)備功能。有研究報(bào)道經(jīng)過(guò)1周期化療AMH急劇降低，基線AMH較高的患者1周期化療后AMH水平仍相對(duì)較高[10-11]，與本研究結(jié)果類(lèi)似。本研究中化療結(jié)束時(shí)大多數(shù)患者的AMH已降至檢測(cè)下限以下，且E2及FSH均降低至絕經(jīng)后水平，至化療停止6個(gè)月后，AMH、E2與化療結(jié)束時(shí)水平無(wú)明顯差異，F(xiàn)SH均值仍處于絕經(jīng)后范圍內(nèi)，均未能恢復(fù)化療前水平，這些與相關(guān)研究結(jié)果類(lèi)似[12-13]。Yu等[12]的研究報(bào)道，化療后12個(gè)月E2和FSH可恢復(fù)基線水平，而Wenners等[13]的研究結(jié)果與之相反，但兩個(gè)研究中患者的AMH均維持在極低水平。

單從血清學(xué)并不能直接反映原始卵泡的情況，一項(xiàng)人卵巢異種移植模型研究發(fā)現(xiàn)，注射環(huán)磷酰胺48 h后就可出現(xiàn)原始卵泡丟失高峰，而早在注射后12 h，就出現(xiàn)以TUNEL標(biāo)記的原始卵泡凋亡高峰[14]。卵母細(xì)胞凋亡是化療致原始卵泡丟失的主要原因，化療藥物可導(dǎo)致卵母細(xì)胞DNA發(fā)生多種損傷，其中DNA雙鏈斷裂危害最大[14-15]。卵母細(xì)胞在損傷初始可啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)通路，但大多數(shù)修復(fù)失敗，隨后凋亡程序啟動(dòng)，損傷卵母細(xì)胞被清除。烷化劑和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑均能導(dǎo)致原始卵泡DNA雙鏈損傷[15-16]。此外，處于有絲分裂期的生長(zhǎng)期卵泡，對(duì)任何化療藥物都很敏感，包括對(duì)原始卵泡來(lái)說(shuō)低毒的藥物[15]。另一方面，生長(zhǎng)期卵泡受到損害后，其對(duì)原始卵泡招募的抑制作用減弱，原始卵泡招募增多繼而過(guò)度活化[17]，加速原始卵泡消耗。此外，化療藥物還可造成卵巢血管并發(fā)癥，如阿霉素可導(dǎo)致卵巢血管痙攣，血流量急劇減少，新生及成熟血管密度降低[15,18]。不但原始卵泡依賴(lài)充足的血管生成，生長(zhǎng)期卵泡同樣如此，并且對(duì)急性缺血更加敏感，卵巢血管密度和原始卵泡凋亡之間呈負(fù)相關(guān)[19]。最終，多次化療致使原始卵泡加速耗竭。

通?；熕幬锇雌鋵?dǎo)致不孕風(fēng)險(xiǎn)的高低分為以下幾類(lèi)[20-21]:(1)高風(fēng)險(xiǎn)藥物:烷化劑，包括環(huán)磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、白消安和美法侖等;(2)中等風(fēng)險(xiǎn)藥物:蒽環(huán)類(lèi)抗生素中的阿霉素及表阿霉素;鉑類(lèi)藥物，如順鉑、卡鉑;(3)低風(fēng)險(xiǎn)藥物:紫杉類(lèi)，如紫杉醇、多西紫杉醇;抗代謝藥，如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷;其他蒽環(huán)類(lèi)藥物，如博來(lái)霉素、柔紅霉素;長(zhǎng)春花堿類(lèi)，如長(zhǎng)春新堿。本研究并未發(fā)現(xiàn)化療方案(EC-D/P、TEC、TC)與月經(jīng)改變及化療后卵巢功能有關(guān)。Wenners等[13]的研究結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)FEC、TAC、EC/P、FEC/T、CMF方案與化療后AMH及月經(jīng)狀態(tài)存在相關(guān)性。Dezellus等[11]的研究也發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺累積量(是否超過(guò)1 500 mg/m2)與化療后AMH水平無(wú)關(guān)?？赡艿脑?yàn)樯鲜龌煼桨妇h(huán)磷酰胺，且絕大部分方案為環(huán)磷酰胺與阿霉素/表阿霉素聯(lián)合化療，提示乳腺癌的化療方案中是否包含致不孕的中高風(fēng)險(xiǎn)藥物，特別是高風(fēng)險(xiǎn)藥物，可能成為化療后卵巢功能損傷的決定因素。

本研究中有95%患者出現(xiàn)CIA，化療結(jié)束后6個(gè)月有78.5%的患者未恢復(fù)月經(jīng)，與相關(guān)報(bào)道類(lèi)似[11,13]。本研究還發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)CIA的患者年齡較大而基線AMH較低，月經(jīng)恢復(fù)和化療后6個(gè)月AMH除了與年齡小、基線AMH高有關(guān)外，還與較低的基線E2水平相關(guān)。Wenners等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)閉經(jīng)與基線AMH水平相關(guān)，化療后卵巢儲(chǔ)備功能與年齡呈負(fù)相關(guān)，與基線AMH呈正相關(guān)。由于化療后部分女性雖能保持多年規(guī)律月經(jīng)卻因卵巢儲(chǔ)備功能顯著降低而不孕[5]。因此，除年齡因素外[22]，在卵巢衰竭前使用生化指標(biāo)評(píng)估生育期乳腺癌女性卵巢儲(chǔ)備功能方面具有重要的臨床意義，除了可發(fā)現(xiàn)化療方案對(duì)卵巢的損傷并長(zhǎng)期評(píng)估卵巢功能以外，更有利于早期識(shí)別卵巢儲(chǔ)備功能降低的育齡期乳腺癌患者。結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)有生育需求的乳腺癌女性，特別是年齡偏大及化療前AMH較低、E2較高者，應(yīng)于化療前使她們及時(shí)獲得生育咨詢(xún)，提供如胚胎凍存、卵子凍存、卵巢組織凍存等女性生育功能保留的相關(guān)信息。

本研究的前瞻性設(shè)計(jì)有效避免了對(duì)月經(jīng)狀態(tài)判斷的回憶性偏倚。而因腫瘤治療的時(shí)限要求，隨機(jī)E2、FSH檢測(cè)對(duì)結(jié)果解釋可能有一定影響，此外隨訪至化療結(jié)束后6個(gè)月可能低估月經(jīng)恢復(fù)情況。隨著樣本量的擴(kuò)大及隨訪期延長(zhǎng)至化療結(jié)束后至少1年，可進(jìn)一步判斷年齡、AMH及E2對(duì)CIA或絕經(jīng)的最佳預(yù)測(cè)截?cái)嘀?，還可對(duì)40歲前后患者做亞組分析，將為絕經(jīng)前早期乳腺癌患者生育/卵巢功能保護(hù)及內(nèi)分泌治療方案選擇提供依據(jù)。