張慧， 生秀梅， 舒揚， 向敏， 陰晴△

1江蘇大學附屬醫(yī)院檢驗科(江蘇鎮(zhèn)江 212001)； 2江蘇大學醫(yī)學院檢驗醫(yī)學系(江蘇鎮(zhèn)江 212013)

近20年來，隨著臨床大量使用頭孢菌素類抗生素治療腸桿菌科細菌引起的感染性疾病，導致超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)在腸桿菌科細菌中的流行[1-4]。由于碳青霉烯類抗菌藥物抗菌譜廣、活性強、不良反應少，且對AmpC 酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，臨床常用其治療對頭孢類抗生素耐藥腸桿菌科細菌引起嚴重感染。隨著用量的增加，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)也在逐年遞增，耐藥機制主要是產(chǎn)生了碳青霉烯酶[5-8]。本文研究的 NDM-1碳青霉烯酶屬于B類金屬酶，2009年印度新德里首次報道，又稱新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶，幾乎能水解所有β-內(nèi)酰胺類抗生素[9-11]。2010中國首次報道，之后各地對NDM-1基因分布情況也均有報道[12-13]，攜帶NDM-1碳青霉烯酶的細菌會對臨床常用多種抗生素呈高度耐藥，臨床治療此類感染十分棘手。本文收集江蘇大學附屬醫(yī)院45株CRE，分析NDM-1型碳青霉烯酶基因攜帶率及常用抗生素耐藥情況,為我院臨床治療和防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集江蘇大學附屬醫(yī)院2017 年1月至2018 年6月各類送檢標本中分離出的CRE共45 株，標本來源包括痰標本30株，分泌物標本5株，膽汁標本1株，全血標本2 株，膿液標本2，中段尿標本4株，咽試子標本1株。剔除同一患者、同一標本類型重復菌株。

1.2 主要試劑 革蘭陰性桿菌鑒定卡GN卡及革蘭陰性桿菌藥敏卡AST-GN13(上海梅里埃診斷產(chǎn)品有限公司)；血平板培養(yǎng)基及M-H培養(yǎng)基購置于(上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司)；亞胺培南E-test試紙條及美羅培南藥敏紙片(溫州市康泰生物科技有限公司)；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA) 為江蘇大學醫(yī)學院惠贈；Agarose瓊脂粉(BIO-FRoxx公司)；核酸染料(上海翌圣生物科技有限公司)；PCR反應試劑及 Marker DL2000(上海皓嘉科技發(fā)展有限公司)；凝膠電泳 Marker DL2000；引物合成(上海生工生物工程股份有限公司)

1.3 主要儀器 VITEK-2 COMPACT鑒定儀；S1000TMThermal Cycler PCR儀(BIO-RAD公司)；DYY-68穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(南京新校園生物技術(shù)研究所)；凝膠成像分析系統(tǒng)JS-680D(上海培清科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株鑒定及藥敏試驗 取過夜培養(yǎng)的純菌落于3 mL 0.45%生理鹽水中,調(diào)節(jié)菌液濃度0.51～0.62麥氏單位，放置GN卡，由VITEK-2 COMPACT細菌鑒定儀鑒定，無菌槍頭吸取0.51～0.62麥氏單位的菌液145 μL于另一支3 mL 0.45%生理鹽水中，上AST-GN13藥敏卡，VITEK-2 COMPACT細菌鑒定儀藥敏試驗。篩出CRE,再重新挑取純培養(yǎng)的CRE的單個菌落放于1.5 mL 0.9%生理鹽水中，調(diào)節(jié)菌液濃度0.50麥氏單位，無菌棉拭子浸入菌液中，將多余菌懸液擠出， 均勻涂布整個M-H瓊脂板，旋轉(zhuǎn)M-H瓊脂板60℃，重復涂布3次，最后用棉拭子涂抹瓊脂邊緣，無菌鑷子夾取亞胺培南E-test試紙條貼于M-H瓊脂板中央，置于35℃培養(yǎng)箱中孵育16～18 h，復查藥敏試驗結(jié)果。依據(jù)2018版CLSI藥敏解釋判斷標準進行判斷：厄他培南MIC≤0.5 μg/mL敏感(s)，MIC=1中介(I), MIC≥2 μg/mL耐藥(R)。亞胺培南MIC≤1 μg/mL敏感(s)，MIC=2中介(I), MIC≥4 μg/mL耐藥(R)。

1.4.2 改良的 Hodge 試驗 取過夜新鮮培養(yǎng)大腸埃希菌 (ATCC25922) 調(diào)制成0.5麥氏單位的菌液，再稀釋10倍，無菌棉拭子浸入菌液中，將多余菌懸液擠出，均勻涂布在 M-H 瓊脂平板上，中間貼美羅培南(10 μg/片)藥敏紙片，用接種環(huán)將實驗菌株以美羅培南紙片邊緣為起點，垂直劃線，置于35℃孵育16～18 h，觀察結(jié)果，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)矢狀生長為陽性，無矢狀生長為陰性。

1.4.3 EDPT試驗 配制0.5 麥氏單位試驗菌株菌懸液，均勻涂布于 M-H 瓊脂培養(yǎng)基，貼1張美羅培南(10 μg/片)藥敏紙片，然后再貼1張加有10 μL EDTA (0.2 mol/L)干燥美羅培南藥敏紙片，2紙片間距≥4 cm，35℃ 過夜培養(yǎng)，若 2 張紙片抑菌圈直徑之差≥5 mm 則表示試驗菌株EDPT陽性，提示菌株產(chǎn) B 類碳青霉烯酶。

1.4.4 細菌基因組DNA的制備(煮沸法) 取血瓊脂平板上過夜純培養(yǎng)的實驗菌株，無菌挑取2個菌落至裝有滅菌雙蒸水的1.5 mL EP管中，打勻，100℃煮沸10 min，4℃，9 600×g離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入另一滅菌EP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 NDM-1酶基因檢測 采用PCR技術(shù)擴增NDM-1酶基因。引物序列(5′-3′)上游Forward: 5′-CTCGCACCGAATGTCTGGC-3′,下游Reverse: 5′-CATTGGCGGCGAAAGTCA-3′，片段長度374 bp。PCR反應體系：(Ex Taq Version 2.0 plus dye) 25 μL，引物各1 μL,模板1 μL，加滅菌水到50 μL。PCR反應條件：預變性94℃×5 min，98℃變性10 s，59℃ 30 s,72℃ 1 min，共 30 個 循 環(huán),；72℃ 10 min延伸10 min，1.2%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀分析并拍照。留取PCR未純化的目的產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序部測序，測序結(jié)果在 Genebank 中比對分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定及藥敏試驗結(jié)果 45株細菌經(jīng)VITEK-2 COMPACT細菌鑒定儀鑒定26株肺炎克雷伯菌，6株粘質(zhì)沙雷菌，5株陰溝腸桿菌，5株大腸埃希菌、2株植生拉烏爾菌、1株摩氏摩根菌。其中4株細菌藥敏結(jié)果顯示僅對亞胺培南耐藥；4株細菌菌僅對厄他培南耐藥,37株細菌對亞胺培南和厄他培南藥敏試驗結(jié)果均顯示耐藥，E-test試紙條復查亞胺培南藥敏結(jié)果與VITEK-2 COMPACT細菌鑒定儀藥敏結(jié)果基本一致，45株細菌符合CRE的判斷標準。見表1。表達NDM-1基因菌株對臨床常用抗菌藥物的耐藥情況：碳青霉烯類抗生素厄他培南及亞胺培南的耐藥率是100%、88.2%。三代頭孢耐藥率在94.1%～100%之間。環(huán)丙沙星及左氧氟沙星喹諾酮類抗生素的耐藥率是94.1%。四代頭孢頭孢吡肟的耐藥率是82.3%；單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率76.5%；含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合制劑的耐藥率70.6%。對氨基糖甙類抗生素的耐藥率在35.3%～64.7%之間。復方新諾明的耐藥率是52.9%。見表2。

表1 45株細菌對碳青酶烯類藥物耐藥情況分析表棵(%)

表2 17株表達NDM-1基因菌株對臨床常用抗菌藥物的耐藥情況分析表 株(%)

2.2 改良的 Hodge 試驗及EDPT結(jié)果 45株細菌中共 34 株細菌菌改良Hodge 試驗結(jié)果呈陽性，陽性率為75.6%。27株EDPT試驗結(jié)果呈陽性，陽性率為60.0%。17株產(chǎn)NDM-1菌株中，11株改良Hodge 試驗陽性結(jié)果顯示陽性，陽性率為64.7%。陽性菌株包括6株肺炎克雷伯菌35.3%(6/17)、3株大腸埃希菌17.6%(3/17)、1株陰溝腸桿菌5.9%(1/17)、1株植生拉烏爾菌5.9%(1/17)。17株產(chǎn)NDM-1菌株EDPT驗結(jié)果均呈陽性，陽性率100%，見表3。

表3 17株產(chǎn)NDM-1菌株改良Hodge 試驗及EDPT陽性菌株分布 株(%)

2.3 NDM-1基因擴增及測序結(jié)果 45株細菌進行PCR擴增有17株細菌在374 bp處擴增出目的條帶，留取未純化的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序,序列經(jīng)Blast 軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對，與已知的NDM-1基因相似性為100%。陽性率為37.8%(圖1)。其中肺炎克雷伯菌占64.7%(11/17)，大腸埃希菌占17.6%(3/17)，陰溝腸桿菌占11.8(2/17)，植生拉烏爾菌占5.9%(1/17)。

3 討論

45株實驗菌株改良的Hodge 試驗陽性率為75.6%，EDPT試驗陽性率為60%。17株產(chǎn)NDM-1菌株改良Hodge 試驗陽性率為64.7%，而EDPT驗陽性率100%，表明改良的Hodge 試驗篩查細菌產(chǎn)碳青霉烯酶的敏感性尚可，而對B類金屬酶，敏感性及特異性不高，應聯(lián)合EDPT共同篩查提高B類金屬酶檢出率[14-17]。

45株實驗細菌，有17株表達NDM-1基因，陽性率是37.8%，涉及多個菌屬，以肺炎克雷伯菌為主共11株，其次是3株大腸埃希菌、2株陰溝腸桿菌、1株植生拉烏爾菌。17株陽性標本11株分離自痰標本，4株分離自分泌物，1株分離自中段尿，1株分離于血液。與國內(nèi)其他醫(yī)院NDM-1基因分布的菌株類型及標本類型略有差異。并且研究中發(fā)現(xiàn)我院一株植生拉烏爾菌表達NDM-1基因。國內(nèi)外對耐碳青霉烯類藥物的植生拉烏爾菌研究較少，僅有少量文獻報道植生拉烏爾菌表達KPC，IMP-4及0X-48基因[18-19]。目前國內(nèi)僅有北京及浙江地區(qū)3例植生拉烏爾菌表達NDM-1的報道[20-21]。江蘇省地區(qū)尚屬首例，醫(yī)院應加以重視。

M:DNA標準條帶；1～45:實驗菌株；374 bp目的基因的長度

據(jù)研究，一般表達NDM-1基因的超級細菌，可能會導致該細菌對多種抗生素耐藥，呈泛耐藥或多重耐藥特性[22-23]。通過我院分離的產(chǎn)NDM-1陽性菌株體外藥敏結(jié)果也顯示對多種抗生素耐藥。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率>70%，其中以三代頭孢的耐藥率最高達94.1%。原因是由于NDM-1基因編碼的產(chǎn)物不僅可以水解碳青霉烯類抗生素，對頭孢類的抗生素也有水解作用，并且產(chǎn)NDM-1的細菌同時也會產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，此酶對三代頭孢亦有水解作用。喹諾酮類抗菌藥耐藥率也高達94.1%。氨基糖甙類抗生素中慶大霉素的耐藥率達64.7%。有研究表明，攜帶NDM-1基因的細菌一般也會攜帶喹諾酮類及氨基糖苷修飾酶耐藥基因，導致對兩類藥物產(chǎn)生耐藥。復方新諾明耐藥率要低于其他抗生素。由此可見，產(chǎn)NDM-1細菌攜帶多種耐藥基因?qū)е聦Χ喾N抗生素耐藥，并且這些耐藥基因可通過質(zhì)粒、接合子在不同的菌種間傳播，存在爆發(fā)流行的風險，給臨床治療感染性疾病帶來巨大挑戰(zhàn)[24-25]。

目前在我院CRE中NDM-1基因的攜帶率較高，并且該基因的攜帶者主要分布在ICU重癥監(jiān)護病房、血液科及神經(jīng)內(nèi)科，多為高齡抵抗力較差有侵襲性操作的重癥感染患者，此類患者往往都有過度使用抗生素的經(jīng)歷，而臨床過度使用抗生素多是由于對引起感染的病原體的不明確，憑經(jīng)驗用藥。這樣的嚴峻形勢下，需要我們臨床微生物室不僅要重視分析藥敏試驗結(jié)果，探討耐藥機制掌握細菌的耐藥特征，還有加強臨床溝通、參與臨床查房，指導臨床正確收集標本，快速準確鑒定與患者癥狀相關(guān)的病原體并提供相應的藥敏實驗結(jié)果，為臨床合理應用抗生素提供依據(jù)，在降低多重耐藥菌的播散方面發(fā)揮更大的作用。同時臨床科室在合理應用抗生素的前提下，也要注重重癥患者的隔離及環(huán)境消毒、診治護理患者時嚴格遵守操作規(guī)范，避免醫(yī)源性交叉感染。檢驗與臨床共同攜手降低我院NDM-1基因的攜帶率。