李鉑，唐志書*，王楠，黃文靜，孫曉春，宋忠興，王二歡，劉峰，王益民

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075

當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，是我國常用的大宗藥材之一[1]。當(dāng)歸又稱岷歸、云歸、秦歸，主要分布于甘肅、云南、四川、陜西等地[2]。甘肅岷縣、宕昌縣等地當(dāng)歸栽培歷史悠久，種植面積廣，種植技術(shù)成熟，藥材品質(zhì)上乘[3]。水楊酸(salicylic acid，SA)作為參與脅迫應(yīng)答的一種信號分子，不僅可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins)基因表達(dá)，使機(jī)體產(chǎn)生抗病性，同時(shí)能提高植物對多種逆境脅迫的抗性，適度促進(jìn)植物的生長[4]。外源噴施水楊酸對植物生理特性影響的研究多見于小麥[5]、番茄[6]、黃瓜[7]等農(nóng)作物，也用于促進(jìn)黃芪[8]、丹參[9]、蒼術(shù)[10]等藥用植物種子萌發(fā)、植株生長和有效成分次生代謝調(diào)控等研究。植物體內(nèi)由超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等構(gòu)成的保護(hù)酶系統(tǒng)，是植物應(yīng)對逆境脅迫的重要防御體系之一，能有效地保護(hù)植物，減輕環(huán)境脅迫對植物的傷害。本研究通過采用葉面噴施SA處理基質(zhì)栽培的當(dāng)歸幼苗，考察當(dāng)歸幼苗生長、保護(hù)酶活性對不同濃度SA的響應(yīng)水平，為提高當(dāng)歸藥材的品質(zhì)、指導(dǎo)藥材生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

當(dāng)歸種子采自甘肅省宕昌縣阿塢鄉(xiāng)麻界村陜西步長制藥當(dāng)歸規(guī)范化種植基地。GPS信息：104°09′41.84" E，34°16′56.21" N，海拔2406 m。選取顆粒飽滿、大小均一的當(dāng)歸種子，經(jīng)除雜、消毒后，用蒸餾水沖洗三次，取出，吸干種子表面水分，備用。

取30 cm×25 cm塑料盆，裝入適量基質(zhì)(PindStrup，Denmark，粒徑0～6 mm，pH 6.0)，將處理好的當(dāng)歸種子播撒于盆中，置于人工氣候箱(20 ℃，2 000 lux，相對濕度50%～60%)；待真葉展開后，每盆留苗20株，每個(gè)處理3盆，共15盆。

1.2 儀器與試劑

儀器：LB-350HPY-2型人工氣候箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，USA)；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)(Shimadzu，Japan)。

試劑：水楊酸(北京索萊寶科技有限公司)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；水為蒸餾水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水楊酸濃度梯度及噴施方法 配制濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0 mmol·L-1的水楊酸溶液，以蒸餾水為對照(CK，0 mmol·L-1)，待基質(zhì)栽培的當(dāng)歸幼苗生長至60 d時(shí)開始葉面噴施，以液滴欲滴為準(zhǔn)，每天噴施一次；分別于處理3、5、7 d取樣，新鮮樣品用于酶活測定，第7天采樣的同時(shí)測定幼苗長度和鮮質(zhì)量。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)[11]。

1.3.2 酶活性測定 取新鮮當(dāng)歸幼苗，洗凈雜質(zhì)，吸干水分，精確稱取0.3 g，加入2.7 mL磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1，pH 7.8)，冰上迅速研磨成勻漿，4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，上清液用于酶活性測定[12]。

當(dāng)歸幼苗蛋白含量采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定(P0010S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；超氧化物歧化酶活性采用總SOD活性檢測試劑盒測定(S0101，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；過氧化物酶活性采用POD活性檢測試劑盒測定(A084-3，南京建成生物工程研究所)；過氧化氫酶活性采用CAT活性檢測試劑盒測定(A007-1，南京建成生物工程研究所)。酶活力單位以U·mgprot-1蛋白含量表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，運(yùn)用單因素方差分析結(jié)合多重比較進(jìn)行多組樣本間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸處理對當(dāng)歸幼苗生長的影響

低濃度的SA可以促進(jìn)當(dāng)歸幼苗的生長，株高、鮮質(zhì)量增加明顯，葉片呈現(xiàn)深綠色(圖1)。0.5 mmol·L-1SA處理當(dāng)歸幼苗7 d，株高為12.40 cm，是對照組的135.2%，此時(shí)鮮質(zhì)量為0.193 4 g，是對照組的224.6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。隨著SA處理濃度增加，株高逐漸下降，葉片發(fā)黃，當(dāng)歸幼苗生長受到明顯抑制。當(dāng)濃度達(dá)到2.0 mmol·L-1時(shí)(處理7 d)，當(dāng)歸幼苗葉片發(fā)生卷曲，植株弱小，此時(shí)鮮質(zhì)量僅為對照組的72.7%。

圖1 不同濃度水楊酸處理的當(dāng)歸幼苗形態(tài)變化(7 d)

注：*P<0.05。圖2 不同濃度水楊酸處理的當(dāng)歸幼苗生長指標(biāo)比較(7 d)

2.2 水楊酸處理對當(dāng)歸幼苗保護(hù)酶活性的影響

2.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性變化 不同濃度SA處理當(dāng)歸幼苗3、5 d后，各處理組之間SOD活性相比對照組略有增加，不同組別間差異不明顯。隨著外源SA處理時(shí)間的延長和處理濃度的增加，SOD活性表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，處理后期(7 d)增加幅度明顯。1.0、2.0 mmol·L-1SA噴施當(dāng)歸幼苗7 d后，SOD活性增加顯著，分別達(dá)到1.192 U·mgprot-1和1.092 U·mgprot-1，分別為對照組的149.1%(P<0.01)和136.6%(P<0.05)(圖3)。說明1.0 mmol·L-1的水楊酸為提高當(dāng)歸幼苗SOD活性的最佳濃度。

注：*P<0.05，**P<0.01。圖3 不同濃度水楊酸處理當(dāng)歸幼苗SOD酶活性比較

2.2.2 過氧化物酶(POD)活性變化 由圖4可知，POD活性隨水楊酸處理濃度和處理時(shí)間的增加，呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢。不同濃度SA處理當(dāng)歸幼苗3 d，POD活性以0.5 mmol·L-1處理的提高幅度為最大，達(dá)到26.26 U·mgprot-1，是對照組的116.5%。1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1水楊酸處理當(dāng)歸幼苗5 d，POD活性增加幅度明顯，分別達(dá)到26.47 U·mgprot-1和28.33 U·mgprot-1，相比對照組分別提高35.54%和45.06%，達(dá)到顯著差異水平(P<0.01)。低濃度SA處理7 d，POD活性相比對照組有所下降，1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1水楊酸處理的當(dāng)歸幼苗，POD活性顯著增加，分別為對照組的138.2%(P<0.01)和146.6%(P<0.01)，但高濃度的水楊酸處理對當(dāng)歸幼苗生長的抑制作用明顯(圖1)。綜合多項(xiàng)指標(biāo)，噴施1.0 mmol·L-1水楊酸為提高當(dāng)歸幼苗體內(nèi)過氧化物酶活性的適宜處理方式。

注：*P<0.05，**P<0.01。圖4 不同濃度水楊酸處理當(dāng)歸幼苗POD酶活性比較

2.2.3 過氧化氫酶(CAT)活性變化 外源SA處理當(dāng)歸幼苗，對照組和處理組CAT活性保持總體下降的趨勢(圖5)。1.0 mmol·L-1水楊酸處理當(dāng)歸幼苗，CAT活性在處理3 d時(shí)達(dá)到最高15.46 U·mgprot-1，相比對照組提高45.6%。不同濃度水楊酸處理5 d時(shí)，當(dāng)歸幼苗中CAT活性在7.75～10.88 U·mgprot-1之間，均顯著高于對照組(5.42 U·mgprot-1)；噴施

注：*P<0.05，**P<0.01。圖5 不同濃度水楊酸處理當(dāng)歸幼苗CAT酶活性比較

1.0 mmol·L-1水楊酸5 d，CAT活性亦增加顯著，為對照組的194.7%。SA處理后期，當(dāng)歸幼苗中CAT活性增加不明顯，僅1.0 mmol·L-1水楊酸處理7 d時(shí)，CAT活性為10.84 U·mgprot-1，相比對照組提高36.35%(P<0.01)。由此可看出，1.0 mmol·L-1水楊酸處理當(dāng)歸幼苗，能夠顯著增加CAT活性。

3 討論

水楊酸作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑和信號分子，能夠促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和伸長，誘導(dǎo)一系列與抗逆有關(guān)的基因表達(dá)，提高植物體內(nèi)保護(hù)酶活性，以緩解環(huán)境脅迫對植物造成的傷害。葉面噴施是促進(jìn)植物生長和次生代謝物積累的有效手段。薛建平等[13]利用0.5 mmol·L-1SA噴施半夏植株，葉綠素含量和胞間CO2濃度顯著增加，使得半夏同化更多的有機(jī)物，表現(xiàn)為塊莖鮮質(zhì)量的增加；同時(shí)，SA處理后植株MDA含量降低，SOD保護(hù)酶活性提高。Giménez等[11]利用0.5 mmol·L-1水楊酸對采收期甜櫻桃進(jìn)行處理，果實(shí)的色澤、硬度、可溶性固形物、總酚酸含量，以及保護(hù)酶活性顯著提高。韓鳳等[14]對管萼山豆根進(jìn)行葉面施肥，植株的年生長高度及年增長率顯著提高。說明合理濃度范圍的SA處理對藥用植物的生長具有一定的促進(jìn)作用。本研究中，噴施0.5 mmol·L-1SA對當(dāng)歸幼苗株高和鮮質(zhì)量的增加具有促進(jìn)作用，而較高濃度的水楊酸明顯抑制了當(dāng)歸幼苗的生長，表現(xiàn)出輕微的毒害作用，這與前人的研究報(bào)道基本一致。

同時(shí)，葉面持續(xù)噴施1.0 mmol·L-1的水楊酸能夠適度提高當(dāng)歸幼苗SOD、POD、CAT活性，且酶活性的最大值多出現(xiàn)于處理的中后期，即當(dāng)歸幼苗對水楊酸的響應(yīng)存在明顯的濃度依賴性和滯后性。這可能是由于葉面噴施水楊酸處理當(dāng)歸幼苗后，植物體內(nèi)防御機(jī)制被啟動，導(dǎo)致參與防御反應(yīng)的相關(guān)酶活性升高。

本研究以當(dāng)歸這一傳統(tǒng)大宗藥材作為研究材料，采用葉面噴施的手段，考察基質(zhì)栽培的當(dāng)歸幼苗生理特性和保護(hù)酶活性對外源水楊酸的響應(yīng)情況，并在此基礎(chǔ)上篩選出適宜的水楊酸處理濃度，對當(dāng)歸種子種苗選育和大田生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義，可為提升當(dāng)歸藥材產(chǎn)量和品質(zhì)提供參考。在此研究基礎(chǔ)上，后續(xù)將進(jìn)一步開展外源噴施水楊酸對當(dāng)歸有效成分積累和次生代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)調(diào)控等研究，結(jié)合生理生化指標(biāo)的變化，以期為SA在當(dāng)歸生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供一定的理論和實(shí)踐依據(jù)。