任海琴，呂秋月，彭玉德，林雨珊，王立晶，陳四保，*

1.香港理工大學(xué) 深圳研究院 中藥藥學(xué)及分子藥理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育基地)，廣東 深圳 518057；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；3.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023

鵝不食草Centipedaminima(L.)A.Br.et Aschers.系菊科(Asteraceae)石胡荽屬植物，又名石胡荽，其全草為常用中藥，具有發(fā)散風(fēng)寒，通鼻竅，止咳之功效；臨床上用于治療急慢性、過敏性鼻炎，病毒性感染等[1]。鵝不食草中含有黃酮、苯丙素、倍半萜等化學(xué)成分[2-4]；具有抗氧化、抗炎[5]和抗腫瘤活性[6-7]。

對(duì)于鵝不食草的質(zhì)量控制，《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)缺少含量測(cè)定。已報(bào)道的含量測(cè)定方法主要是分析有機(jī)酸和黃酮類成分[8-10]。但越來越多的研究表明，鵝不食草的抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性與其中的倍半萜內(nèi)酯化合物有關(guān)[4，11-14]，因此，測(cè)定倍半萜內(nèi)酯化合物的含量，可以更加科學(xué)地反應(yīng)鵝不食草藥材的質(zhì)量。然而，迄今為止，對(duì)鵝不食草中的倍半萜內(nèi)酯含量測(cè)定，僅見對(duì)其中兩個(gè)成分的測(cè)定[10，15]。

為了更加客觀地反應(yīng)鵝不食草的藥材質(zhì)量，本研究建立了高效液相測(cè)定5個(gè)主要倍半萜內(nèi)酯化合物的含量測(cè)定方法，為鵝不食草的質(zhì)量控制提供研究基礎(chǔ)。

注：1.山金車內(nèi)酯D；2.山金車內(nèi)酯C；3.minimolide F；4.小堆心菊素C；5.短葉老鸛草素。圖1 對(duì)照品化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測(cè)器(日本島津公司)；XS205型十萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；AY220型萬分之一電子天平(日本島津公司)；Elmasonic P 180H型超聲波清洗器(德國(guó)Elma公司)；HETTICH ZENTRIFUGEN 1205型離心機(jī)(德國(guó)Hettich Zentrifugen公司)；Milli-Q超純水機(jī)(德國(guó)密理博公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品：山金車內(nèi)酯D、山金車內(nèi)酯C、Minimolide F、小堆心菊素C和短葉老鸛草素均為本實(shí)驗(yàn)室從鵝不食草中分離得到，其化學(xué)結(jié)構(gòu)(如圖1所示)通過測(cè)定它們的譜學(xué)數(shù)據(jù)(IR，UV，MS，NMR)并對(duì)照文獻(xiàn)而確定[16]，其純度由HPLC面積歸一化法測(cè)定均大于98%。甲醇和乙腈均為色譜純(Fisher化學(xué)試劑公司)；超純水由Milli-Q制備。10批樣品采自于不同產(chǎn)地，經(jīng)香港理工大學(xué)深圳研究院陳四保教授鑒定為鵝不食草Centipedaminima(L.)A.Br.et Aschers.的干燥全草(表1)。

表1 鵝不食草樣品信息

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為AlltimaTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相由水(A)-乙腈(B)組成，梯度洗脫(0～12 min，38%～44% B；12～25 min，44%～47% B；25～30 min，47%～50% B)；檢測(cè)波長(zhǎng)223 nm；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積20 μL；柱溫35 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液制備

取對(duì)照品山金車內(nèi)酯D 3.0 mg，山金車內(nèi)酯C 3.0 mg，minimolide F 9.0 mg，小堆心菊素C 9.0 mg和短葉老鸛草素8.0 mg，精密稱定，用甲醇10 mL溶解，并定容至刻度，即得濃度分別為300、300、900、900、800 μg·mL-1的各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.0、1.0、0.1、0.1、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配置成含山金車內(nèi)酯D 30 μg·mL-1，山金車內(nèi)酯C 30 μg·mL-1，minimolide F 9 μg·mL-1，小堆心菊素C 9 μg·mL-1和短葉老鸛草素80 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液制備

取鵝不食草樣品(批號(hào)EBSC-1)粉末(過2號(hào)篩)0.5 g，精密稱重，置于50 mL離心管中，加甲醇10 mL，超聲處理30 min(功率330 W，頻率37 KHz)，離心5 min(4000 r·min-1)，收集上清液；殘?jiān)? mL甲醇重復(fù)提取1次，離心，收集上清液；殘?jiān)? mL甲醇清洗，離心，合并3次上清液于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 精密量取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液0.5 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，吸取20 μL，進(jìn)行HPLC分析，重復(fù)6次，記錄各對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，5個(gè)成分的保留時(shí)間和峰面積RSD均小于2%。同樣，取3批不同樣品溶液(EBSC-1，EBSC-2，EBSC-3)，進(jìn)行HPLC分析，記錄各待測(cè)化合物色譜峰與最近色譜峰之間的分離度(R)、理論塔板數(shù)(N)和拖尾因子(T)。結(jié)果顯示(圖2)，各色譜峰與鄰近的峰分離度(R)均大于1.5，各峰的N值均大于10 000，T值介于0.95～1.10之間，表明該方法具有良好的系統(tǒng)適應(yīng)性。

2.4.2 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限考察 將2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液分別稀釋至6個(gè)不同的濃度，每個(gè)濃度按上述的色譜條件進(jìn)樣分析3次。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行回歸分析，求得各回歸方程和線性范圍。結(jié)果表明5種成分在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。采用信噪比法測(cè)定5種指標(biāo)成分的檢測(cè)限LOD(信噪比S/N=3∶1)及定量限LOQ(信噪比S/N=10∶1)，結(jié)果見表2。

注：1.山金車內(nèi)酯D；2.山金車內(nèi)酯C；3.minimolide F；4.小堆心菊素C；5.短葉老鸛草素。圖2 對(duì)照品(a)和樣品溶液(b)色譜圖

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.4.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液20 μL，進(jìn)行HPLC分析，在同1天之內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的RSD，考察日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)；連續(xù)測(cè)定3天，每天測(cè)定2次，考察日間精密度。結(jié)果如表3所示，5種成分的峰面積的RSD均小于1%(n=6)，表明本方法精密度良好。

表3 精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性測(cè)定結(jié)果

表2 5種倍半萜內(nèi)酯化合物的線性考察、檢測(cè)限和定量限 μg·mL-1

2.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取樣品粉末(EBSC-1)，精密稱定6份，分別按照2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，計(jì)算含量及其RSD。結(jié)果如表3所示，5種成分含量的RSD均小于3%(n=6)，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取室溫下放置的同一份樣品溶液(EBSC-1)，分別于制備后0、2、4、8、16、24、48 h，按2.1項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果如表3所示，5種成分峰面積的RSD均小于3%(n=7)，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(EBSC-1)粉末6份，每份約0.25 g，精密稱定，每份樣品中精密加入一定量的對(duì)照品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定各化合物的含量，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果如表4所示，5種成分的平均回收率在94.09%～106.32%，對(duì)應(yīng)的RSD分別均小于2%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

表4 鵝不食草回收率測(cè)定結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定

取各樣品粉末，精密稱定3份，分別按2.3項(xiàng)方法制備樣品溶液，精密吸取各樣品溶液20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算出含量，結(jié)果見表5，色譜圖見圖2。

表5 鵝不食草樣品中5種倍半萜內(nèi)酯化合物的含量(n=3) μg·g-1

3 討論

3.1 樣品溶液制備

鑒于倍半萜內(nèi)酯化合物脂溶性較大，重點(diǎn)考察了無水有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮對(duì)鵝不食草的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取后所測(cè)得的各指標(biāo)成分平均含量較高；考察了回流和超聲兩種提取方式，結(jié)果顯示兩種提取方法提取效率差異不大，考慮到超聲法簡(jiǎn)便易行的優(yōu)勢(shì)，故選擇超聲法作為樣品提取方法；考察了超聲次數(shù)(每次30 min)的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取2次即可提取完全；因此最終樣品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min，提取2次。

3.2 色譜條件

流動(dòng)相考察了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇和0.1%甲酸水-乙腈，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，各色譜峰的分離度最好，5個(gè)待測(cè)成分的色譜峰純度也都符合含量測(cè)定要求；通過PAD檢測(cè)器優(yōu)選了檢測(cè)波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)223 nm下各被測(cè)物色譜峰強(qiáng)度最高，因此選用223 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)；將柱溫設(shè)置在35 ℃，能使色譜基線平穩(wěn)。

3.3 樣品含量測(cè)定

對(duì)10批次鵝不食草樣品進(jìn)行了含量測(cè)定，各化合物含量在不同的樣品中差異較大，5個(gè)化合物的含量范圍分別為山金車內(nèi)酯D 423.3～1 437.2 μg·g-1，山金車內(nèi)酯C 144.1～498.0 μg·g-1，minimolide F 29.8～159.2 μg·g-1，小堆心菊素C 66.8～188.8 μg·g-1和短葉老鸛草素1 290.1～3 476.4 μg·g-1；從它們的平均含量可以看出，短葉老鸛草素>山金車內(nèi)酯D>山金車內(nèi)酯C>小堆心菊素C>minimolide F，短葉老鸛草素含量最高，平均含量達(dá)到2 224.9 μg·g-1，其次為山金車內(nèi)酯D，平均含量為765.7 μg·g-1。

3.4 小結(jié)

鵝不食草是常用中藥，具有抗炎、抗腫瘤活性，臨床上常用于治療鼻炎和鼻咽癌[17-18]?，F(xiàn)代研究表明其有效成分為倍半萜內(nèi)酯成分，因此，有必要建立該類成分的含量測(cè)定方法，以求達(dá)到客觀地、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)鵝不食草藥材的內(nèi)在質(zhì)量。本研究建立了HPLC/UV測(cè)定鵝不食草中山金車內(nèi)酯D、山金車內(nèi)酯C、minimolide F、小堆心菊素C和短葉老鸛草素等5種倍半萜內(nèi)酯成分含量的方法。樣品采用甲醇超聲提取，選用AlltimaTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為水-乙腈，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)223 nm，流速1 mL·min-1，柱溫35 ℃。系統(tǒng)適應(yīng)性和方法學(xué)考察表明，該方法精密、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好。

對(duì)不同產(chǎn)地的鵝不食草樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明5種成分在不同批次的鵝不食草藥材中的含量差異顯著，說明不同產(chǎn)地的鵝不食草中的倍半萜內(nèi)酯成分會(huì)隨著地理環(huán)境、氣候、光照條件的差異發(fā)生變化。短葉老鸛草素和山金車內(nèi)酯D的含量較高，文獻(xiàn)報(bào)道也具有顯著的生物活性[12-14]，可作為鵝不食草質(zhì)量控制中指標(biāo)性成分。綜合以上結(jié)果，該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，對(duì)鵝不食草的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制具有一定的參考意義。